米汤发酵乳乳酸菌的筛选及其制备工艺

陈大卫，杨壮壮，黄玉军，瓦云超，张玉律，杜杨洋，李春雨

（扬州大学江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室食品科学与工程学院，江苏扬州 225009）

米汤发酵乳乳酸菌的筛选及其制备工艺

陈大卫，杨壮壮，黄玉军，瓦云超，张玉律，杜杨洋，李春雨

（扬州大学江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室食品科学与工程学院，江苏扬州 225009）

从贵州酸汤样品中分离筛选乳酸菌，并研究米汤的添加量、发酵时间、白砂糖添加量等工艺条件对米汤发酵乳感官特性的影响，最终确定米汤发酵乳的最佳工艺配方。结果表明，适合米汤发酵乳发酵的菌株为M-14-3-3和P-3-3-7；当米汤添加量20%，白砂糖添加量8%，两菌株的混合比例1∶1，并以4%的接种量，于37℃下发酵15 h时，米汤发酵乳的口感细腻、酸甜适口，具有米汤特有的清香，其酸度为94.8°T，黏度为1 236 cP，活菌数为1.5×108CFU/mL，理化及微生物指标均符合风味发酵乳产品标准；15 d内具有较好的贮藏特性，乳酸菌活菌数7.5×107CFU/mL，酸度117.3°T，黏度1670 cP。

米汤；发酵乳；制备工艺

米汤性味甘平，具有益气、养阴、润燥的功能，除含有大量的烟酸、VB1，VB2，以及磷、铁等无机盐外，还含有较多的碳水化合物和脂肪等营养元素；同时含有的人体必需脂肪酸含量也高于其他食物，经常喝米汤有助于消化和对脂肪的吸收；米汤中还含有丰富的色氨酸，能够促使大脑神经细胞分泌出一种催人欲睡的“血清素”，有助于睡眠[1]。

乳酸菌作为人体肠道中的重要益生菌，具有调节肠道菌群结构、改善胃肠道功能、增强机体的抗氧化能力和免疫力等功能[2]，被广泛应用于食品发酵。益生乳酸菌发酵米汤的一个重要功能就是具有更完善的营养功能，包括人体必需的糖分、脂肪和蛋白质，同时维生素含量更为丰富，含有18种氨基酸，包括人体必需的8种氨基酸，且每种氨基酸比非发酵米汤含量高，能够更好地发挥抗疲劳和增强机体对外界应激能力的作用。米汤发酵乳还含有多种微量元素，尤其钙、锌、铁、铜含量较丰富，钙能维持人体骨骼和牙齿的健康，具有安定情绪的作用；锌能促进生长发育，增强创伤组织的再生能力，加速组织愈合，增强机体免疫功能；铁是构成血红蛋白的主要成分之一，缺铁可引起缺铁性贫血。因此，随着生活水平的不断提高及自我保健意识的增强，米汤发酵乳越来越受到消费者的欢迎。

贵州“米酸汤”“红酸汤”中的乳酸菌含量较高，且适合于米汤的发酵[3-4]。因此，从中筛选乳酸菌，并以品质较好的糙米为米汤原料，探讨发酵过程中的接菌方式、米汤添加量、发酵时间等发酵条件对米汤发酵乳风味的影响，进而确定米汤发酵乳的最适发酵工艺条件，为米汤发酵乳的工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

米酸汤、红酸汤，贵州农家制备；全脂乳粉，新西兰恒天然公司提供；氢氧化钠、盐酸、胰胨、鱼粉蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、半胱氨酸、吐温-80、氯化钙、硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碳酸氢钠、氯化钠、酚酞，国药集团化学试剂有限公司提供，以上试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

JF-SX-500型全自动灭菌锅，日本TOMY公司产品；SW-CJ-2D型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司产品；培养箱，上海新苗医疗器械有限公司产品；HH-6型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司产品；黏度测定仪（RVD-VII+），Brook Field Engineering Laboratories产品；GYB60-6S型高压均质机，上海东华高压均质机厂产品。

1.2 试验方法

1.2.1 乳酸菌的分离纯化及鉴定

将贵州“米酸汤”“红酸汤”样品经梯度稀释后，采用MRS固体培养基分离样品中的乳酸菌[5]，于37℃下培养48 h，挑取平板上的疑似乳酸菌菌落进行革兰氏染色、镜检，并进行接触酶、KOH、吲哚、运动性等生理生化试验[6]。将纯化后的乳酸菌于MRS液体培养基中于37℃下培养24 h，置于4℃冰箱中贮藏备用或冻干保藏。

1.2.2 乳酸菌的筛选

将活化后的乳酸菌按3%接种量接种至全脂乳培养基中于37℃下培养，参照GB 5009.239—2016[7]的方法分别在0，2，4，6，8，10 h时测定发酵乳的酸度，采用黏度计测定其黏度值。

1.2.3 米汤发酵乳发酵条件的研究

用粉碎机将糙米粉碎（粗粉） 得到米粉，经过100目筛筛选得到精细米粉，混以一定量水经煮沸得到米糊，再过滤取汤则获得原味米汤。将米汤添加到牛乳中发酵。发酵后于4℃下冷藏，之后对发酵乳进行品尝打分。

发酵乳感官评分标准见表1。

表1 发酵乳感官评分标准

（1）接菌方式。将含有20%米汤，9%白砂糖的牛乳均质后杀菌、冷却；将筛选获得的菌种分别以单一菌株及两者比例分别以1∶1，2∶1，1∶2的方式接种后，在41℃条件下发酵16 h，根据表1评定接菌方式对产品感官特性的影响（试验中百分比均以牛奶用量为基准）。

（2） 米汤添加量。将分别含有10%，15%，20%，25%，30%米汤，9%白砂糖的牛乳均质后杀菌、冷却；将混合比例为1∶1的M-14-3-3与P-3-3-7以3%的接种量接种发酵，在41℃条件下发酵16 h，依据表1评定不同米汤添加量对产品感官特性的影响。

（3）发酵时间。将含有20%米汤，9%白砂糖的牛乳均质后杀菌、冷却；将混合比例为1∶1的M-14-3-3与P-3-3-7以3%的接种量接种发酵，于41℃条件下分别发酵10，12，14，16，18 h，依据表1评定不同发酵时间对产品感官特性的影响。

（4）发酵温度。将含有20%米汤，9%白砂糖的牛乳均质后杀菌、冷却；将混合比例为1∶1的M-14-3-3与P-3-3-7以3%的接种量接种发酵，分别在29，33，37，41，于45℃条件下发酵14 h，依据表1评定不同发酵温度对产品感官特性的影响。

（5） 白砂糖添加量。将含有20%米汤及分别含有7%，8%，9%，10%，11%白砂糖的牛乳均质后杀菌，冷却；将混合比例为1∶1的M-14-3-3与P-3-3-7以3%的接种量接种发酵，于37℃条件下发酵14 h，依据表1评定不同白砂糖添加量对产品感官特性的影响。

（6）乳酸菌接种量。将含有20%米汤，9%白砂糖的牛乳均质后杀菌、冷却；将筛选获得的乳酸菌分别以以2.5%，3.0%，3.5%，4.0%，4.5%，5.0%的接种量接种发酵，于37℃条件下发酵14 h，依据表1评定不同乳酸菌接种量对产品感官特性的影响。

（7）正交设计优化试验。在单因素试验结果的基础上，选择米汤添加量、白砂糖添加量、发酵时间及发酵温度作为4个因素，各取3个水平，以感官评价作为指标，设计正交试验表，进行米汤发酵乳发酵工艺的优化。

米汤发酵乳工艺因素与水平设计见表2。

表2 米汤发酵乳工艺因素与水平设计

1.2.4 米汤发酵乳的感官、理化及微生物指标

按照国标GB 19302—2010[8]的方法测定米汤发酵乳的感官、理化及微生物指标。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0对试验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离纯化

从贵州“米酸汤”“红酸汤”样品中分离纯化出16株菌株，其中“米酸汤”中7株，“红酸汤”中9株，分别命名为M-14-3-3，M-14-3-2，M-14-3-1，M-4-7-3，M-4-7-4，M-4-3-2，M-4-3-1，M17-6-3-6，M17-6-3-2，P-1-3-2，P-3-3-2，P-3-3-7，L-4-3-4，L-14-3-3，L-14-7-4，L-4-3-3，对分离的菌株进行革兰氏染色发现，16株菌株为革兰氏阳性，无运动性，过氧化氢酶试验为阴性，KOH试验为阳性，均产酸；综合分析将16菌株初步判定为乳酸菌。

分离菌株的典型形态（光镜×1 600倍）见图1。

图1 分离菌株的典型形态（光镜×1 600倍）

2.2 乳酸菌的产酸能力

16株乳酸菌在12%全脂复原乳中，于37℃下培养10 h内的酸度变化如表3所示；测定菌株培养60 h后的最大产酸量。

乳酸菌的产酸能力见表3，菌株最大产酸量见表4。

由表3可知，大部分菌株发酵10 h的酸度均大于70°T，通过分析还发现，菌株M-14-3-3，M-14-3-1，M-4-7-3，M-4-7-4，M-4-3-1，M17-6-3-6， M17-6-3-2， P-1-3-2， P-3-3-2， P-3-3-7，L-14-3-3，L-4-3-3的最大产酸速率分别为9.00，7.81， 9.39，8.10， 9.65，7.49， 8.99， 5.75，8.55，10.75，8.26 °T/h。M-14-3-3，P-3-3-7 的产酸速率中等，而Anne Saint-eve等人[9]的研究发现，中等产酸速率的菌株能使酪蛋白胶束更稳定且蛋白质网络结构更为坚固。

由表4可知，菌株M-14-3-3，P-3-3-2及P-3-3-7的最大产酸量显著高于其他菌株（p＜0.05），分别为177.64，171.66，176.94°T。根据上述试验结果，选取产酸量大及产酸速率中等的M-14-3-3和P-3-3-7这2株菌株进行下一步试验。

表3 乳酸菌的产酸能力/°T

表4 菌株最大产酸量/°T

2.3 米汤发酵乳的发酵工艺

分别将菌株M-14-3-3，P-3-3-7及其混合后（比例分别为1∶1，2∶1，1∶2） 进行发酵，研究不同的接种量、米汤添加量、发酵时间、发酵温度及白砂糖添加量对米汤发酵乳感官的影响。

米汤发酵乳的评分结果见图2，米汤发酵乳工艺条件正交试验见表5，感官评分直观分析见图3。

由图2（a） 可知，当菌株M-14-3-3，P-3-3-7以1∶1的比例发酵米汤时，其感官评价得分大于单一菌株及其他混合比例发酵；据图2（b） 可知，米汤发酵乳发酵16 h时的感官得分最高，之后评分下降；由图2（c）可知，米汤发酵乳在37℃发酵时感官得分最高，之后评分下降；由图2（d） 可知，米汤发酵乳的感官评分随米汤添加量的增加而增加，当米汤添加量为20%时达到最高，之后开始下降；由图2（e）可知，当白砂糖的添加量为9%时，感官评分最高；由图2（f）可知，米汤发酵乳的感官评分随接菌量的增加而增加，当接菌量为4%时，感官评分最高。

对米汤和白砂糖添加量、发酵时间及温度进行正交试验发现（表5），米汤添加量、白砂糖添加量等因素对米汤发酵乳的感官评价均具有较大影响；表5及图2表明，米汤发酵乳感官评分的较佳工艺参数组合为A2B1C3D2，即米汤添加量20%，白砂糖添加量8%，发酵时间15 h，发酵温度37℃。

2.4 米汤发酵乳产品品质及贮藏特性

2.4.1 米汤发酵乳的产品品质

米汤发酵乳的感官指标见表6，米汤发酵乳的理化指标见表7，米汤发酵乳的微生物指标见表8。

图2 米汤发酵乳的评分结果

表5 米汤发酵乳工艺条件正交试验

图3 感官评分直观分析

表6 米汤发酵乳的感官指标

表7 米汤发酵乳的理化指标

表8 米汤发酵乳的微生物指标

由表6可以看出，米汤发酵乳呈乳白微黄色，具有米汤特有的清香，组织细腻、表面光滑，凝乳均匀、无分层、无乳清析出；由表7可知，米汤发酵乳的酸度和黏度分别为94.8°T，1 236 cP，均在参考标准内；蛋白质及脂肪的含量分别为2.56%，3.35%，均高于参考标准；由表8可知，乳酸菌数为1.5×108CFU/mL，高于参考标准，而大肠杆菌落数为0，低于参考标准；因此，米汤发酵乳的感官、理化及微生物指标均符合风味发酵乳产品的国标标准。

2.4.2 米汤发酵乳的贮藏特性

米汤发酵乳的贮藏特性见表9。

表9 米汤发酵乳的贮藏特性

由表9数据可以看出，米汤发酵乳在贮藏期内的贮藏特性比较好，15 d后的活菌数较高，为7.5×107CFU/mL；后酸化程度较低，酸度为117.3°T，黏度随着贮藏时间的增加而增加，15 d后的黏度为1 670 cP。

3 结论

相关研究发现，乳酸菌发酵含有米汤的牛乳，其VC、叶酸和β-胡萝卜素的含量更丰富[10]，而VC能够促进胶原蛋白的合成，增强机体对外界环境的抗应激能力和免疫力，促进氨基酸代谢和改善钙、铁吸收；叶酸对婴幼儿神经细胞和脑细胞发育有促进作用和抗肿瘤作用，缺乏可引起巨红细胞性贫血及白细胞减少症；β-胡萝卜素是一种抗氧化剂，具有解毒作用，是维护人体健康不可缺少的营养素，对抗癌、预防心血管疾病、白内障及抗氧化有显著功能[11]。同时所含有的有益菌群，同丰富的营养成分一起对调整人体肠道微生态平衡、促进人体健康及预防消化道疾病也具有不可忽视的作用。

由于米汤有丰富的维生素和水溶性膳食纤维，含有促进乳酸菌生长的生长因子，添加到发酵乳中，能够促进乳酸菌生长繁殖，且具有良好的色泽与特别的滋气味，使发酵乳带有天然的乳白色和大米的特殊清香，使得发酵乳既具有诱人的色泽，又酸甜可口。但是，当米汤添加过量时，会对乳酸菌的生长产生较大的影响，使得发酵乳过酸，析出乳清，同时酸味与过浓郁的米汤滋气味相结合，会导致不愉悦的口感与口味的产生。因此，在实际生产中，米汤添加量对米汤发酵乳的口味产生了至关重要的影响；温度对于米汤发酵乳的发酵有较大影响，温度过高会导致酸化过快，不利于风味物质形成，同时也不利于胞外多糖的产生及发酵乳黏度的形成；而一定量的白砂糖既能改善发酵乳的风味又能促进产酸，但白砂糖浓度过高时可以抑制产酸量和细菌生长。

从贵州“米酸汤”“红酸汤”中分离筛选获得的菌株M-14-3-3和P-3-3-7的产酸量较大、产酸速率中等，以4%接种量发酵的米汤发酵乳具有米汤特有的清香、组织细腻、表面光滑、无乳清析出，其酸度和黏度适中，蛋白质及脂肪的含量等理化及微生物指标符合国家标准，乳酸菌活菌数较高；且在贮藏期内理化及微生物指标均符合风味发酵乳的国家标准；其他营养成分在后期试验中还需进一步分析。

[1]李剑欣，张绪梅，徐琪寿.色氨酸的生理生化作用及其应用 [J].氨基酸和生物资源，2005，27（3）：58-62.

[2]陈大卫.辅助降血脂益生乳酸菌的筛选及其对高血脂大鼠肠道菌群的影响 [D].扬州：扬州大学，2014.

[3]石敏，张文学，袁玮，等.“凯里米酸汤”发酵过程中主要微生物及营养成分研究 [J].中国调味品，2014，39（9）：16-19.

[4]张璇.贵州“红酸汤”半成品中微生物区系的研究 [D].重庆：西南大学，2011.

[5]王友湘，陈庆森，阎亚丽.用于乳酸菌分离鉴定的几种培养基的筛选及应用 [J].食品科学，2007，28（9）：374-377.

[6]布坎南R E，吉布斯N E.伯杰氏细菌鉴定手册 [M].第8版.中国科学院微生物研究所,译.北京：科学出版社，1984：660-721.

[7]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 5009.239—2016食品酸度的测定 [S].北京：中国标准出版社，2016.

[8]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 19302—2010食品安全国家标准——发酵乳[S].北京：中国标准出版社，2010.

[9]Anne Saint-eve，Nathalie Martin，Hervé Guillemin，et al.Flavored yogurt complex viscosity influences real-time aroma release in the mouth and sensory properties[J].Journal of Agricultural&Food Chemistry，2006，54（20）：794-803.

[10]Ströhle A，Hahn A.Vitamin C and immune function[J].Medizinische Monatsschrift fur Pharmazeuten， 2009， 32（2）：49-54.

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Screening on Lactic Acid Bacteria of Rice Water Fermented Milk and its Processing

CHEN Dawei，YANG Zhuangzhuang，HUANG Yujun，WA Yunchao，ZHANG Yulv，DU Yangyang，LI Chunyu
（Key Laboratory of Dairy Biological Technology and Safety Control，College of Food Science and Engineering，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009，China）

Lactic acid bacteria （LAB） were screened from sour soup in Guizhou，and the rice water content，fermentation time，addition content of sucrose and other effects of process conditions on rice fermented milk sensory characteristics were studied，and the optimum formula of rice fermented milk were confirmed.The results showed that the obtained strains M-14-3-3 and P-3-3-7 were suitable for rice fermented milk fermentation，which was delicate taste，sweet and sour with suitable mouth and with the unique fragrance of rice when the rice water content 20%，sucrose 8%，and the inoculation amount of proportion of strains（1∶1） 4%，37 ℃ fermentation 15 h，and acidity 94.8 °T，viscosity 1 236 cP，viable count of LAB 1.5×108CFU/mL，and physicochemical and microbial indexes were in line with national standards.The rice fermented milk had the good storage characteristics in the 15 days storage period，which the viable count 7.5×107CFU/mL， the acidity 117.3 °T，and the viscosity 1 670 cP.

rice soup；fermented milk；fermentation process

TS201.3

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.12.007

1671-9646（2017） 12a-0022-05

2017-10-09

国家自然科学基金青年基金项目（31701627）；江苏省高校自然科学研究面上项目（17KJB550009）；江苏省高校自然科学研究重大项目（17KJA550004）；扬州大学大学生科技创新基金“益生菌发酵果蔬汁的制备及活性物质的研究”（201605）；扬州大学教改课题博士专项课题（YZUJX2017-17B）。

陈大卫（1986— ），男，博士，讲师，研究方向为乳品科学。