高效液相色谱法测定银蜜片中麦角甾醇含量

许 莉，赵小勤，文永盛 ，周世玉

（四川省成都市食品药品检验研究院，四川 成都 610045）

高效液相色谱法测定银蜜片中麦角甾醇含量

许 莉，赵小勤，文永盛 ，周世玉

（四川省成都市食品药品检验研究院，四川 成都 610045）

目的 建立测定银蜜片中麦角甾醇含量的高效液相色谱法。方法 色谱柱采用Agilent Eclipse plus C18柱(250 mm×4.6 mm，5 m)，流动相为甲醇 －水（93∶7），流速为 1.0 mL／min，检测波长为 283 nm，柱温为 35℃。结果 麦角甾醇进样量在 0.09～1.02 g范围内与峰面积线性关系良好，回归方程为 Y＝1 508.708 1 X＋26.629 2（r＝0.999 8），平均加样回收率为 97.50% ，RSD 为 2.05%(n＝9)。结论 该法简便、准确、灵敏度高、重复性好，可作为银蜜片的质量控制方法。

银蜜片；麦角甾醇；含量测定

银蜜片选用具有扶正固本作用的银耳耳基粉和有活血功能的天麻蜜环菌粉配制而成，可增加冠状动脉血流量，降低冠脉阻力，改善心肌缺血，还具有止咳化痰、镇静安眠、提高机体免疫力的功效，用于冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)、慢性支气管炎、神经衰弱等症[1－3]。银蜜片现行质量标准[4]中仅有理化鉴别，无含量测定项，专属性和质量可控性差。麦角甾醇广泛存在于药用真菌子实体和发酵菌丝中，是真菌细胞膜的重要组分，也是真菌类的特征化合物。以麦角甾醇为代表的甾醇类成分具有抗肿瘤、抗炎、促进免疫、抗菌、降低胆固醇等多种药理作用[5－10]。为保证临床用药效果，更好地控制银蜜片的质量，本研究中建立了测定银蜜片中麦角甾醇含量的高效液相色谱法，为其质量控制提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪，Agilent 1260型高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；Waters－e 2695型高效液相色谱仪(沃特世科技有限公司）；AE240型电子天平(德国赛多利斯公司）；AUX220型电子天平(日本岛津公司）；HH－4型数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司）；SK250H型超声波清洗机器(上海科导超声仪器有限公司）等。

1.2 试药

麦角甾醇对照品（批号为111845－201102，含量为97.7%，供含量测定用）由中国食品药品检定研究院提供；银密片(山西康欣药业有限公司，批号分别为150502，151001，151201)；甲醇、乙腈为色谱纯（美国Fisher公司）；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：AgilentEclipse plus C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 － 水（93 ∶7）；流速：1.0 mL ／min；检测波长：283 nm；柱温：35℃。理论板数按麦角甾醇峰计算应不低于3 000。在此色谱条件下的色谱图见图1。

2.2 溶液制备

称取麦角甾醇对照品 17.45 mg，精密称定，置100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.170 5 g／L的对照品贮备液。取本品20片，除去糖衣，精密称定，研细，取1.5 g，精密称定，置索氏提取器中，加入70%甲醇100 mL，索氏回流提取4 h，提取液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用 0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

图1 高效液相色谱图

2.3 方法学考察

线性关系考察：精密量取对照品贮备液1.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液Ⅰ，质量浓度为0.017 05 g／L；精密量取对照品浓溶液3.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液Ⅱ，质量浓度为0.051 15 g／L。精密吸取对照品溶液Ⅰ5，10，15，20 μL 和对照品溶液Ⅱ10，15，20 μL，分别注入液相色谱仪，依法测定。以进样量(μg)为横坐标、峰面积(A)为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程 Y＝1 508.708 1 X＋26.629 2（r＝0.999 8）。结果表明，麦角甾醇进样量在 0.09 ～ 1.02 μg 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取麦角甾醇对照品溶液（0.017 05 g／L）20 μL，重复进样 6 次。结果峰面积的RSD为1.46%(n＝6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一（批号为150502）供试品溶液，分别于 0，2，4，8，16，24 h 时注入高效液相色谱仪，测定峰面积。结果的 RSD为 0.74%(n＝6)，表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：取同一批（批号为150502）样品1.5 g，精密称定，共称取6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，测定峰面积结果，计算含量。麦角甾醇平均含量为0.074 mg／g，RSD 为 0.85%(n ＝6)，表明该方法重复性良好。

加样回收试验：称取已知含量的供试品（批号为150502）0.75 g，精密称定，共称取 9 份，分别精密加入一定量的对照品溶液（质量浓度为 0.170 5 g／L），按2.2项下方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定峰面积，计算回收率。结果见表1。

表1 麦角甾醇加样回收试验结果(n＝9)

2.4 样品含量测定

取3批样品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定峰面积，计算含量。结果批号为150502，151001，151201的 3批样品中麦角甾醇含量分别为0.020，0.019，0.014 mg ／g。

3 讨论

3.1 色谱条件优化

采用紫外－可见分光光度仪对麦角甾醇的甲醇溶液在200～400 nm波长范围进行扫描，结果 λmax为283 nm，确定283 nm作为本试验的检测波长。考察了甲醇－水（91 ∶9）、甲醇 － 水（93 ∶7）、甲醇 － 水（95 ∶5），乙腈 － 水（95∶5）等体系下的麦角甾醇对照品峰形及样品中麦角甾醇与其他成分的分离情况。结果表明，甲醇－水（93∶7）流动相条件下，麦角甾醇峰形窄、对称，能与样品中其他成分分离，且试验操作简便。故确定甲醇－水（93∶7）为流动相。在拟订色谱条件下，比较了不同色谱柱[Agilent Eclipse plus C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，Dikma C18柱 (200 mm ×4.6 mm，5 μm)，Sepax GP －C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)]、不同仪器[Agilent 1200 型高效液相色谱仪、Agilent 1260型高效液相色谱仪、Waters－e2695型高效液相色谱仪]，麦角甾醇色谱峰均可达到基线分离，峰形对称，理论板数均在10 000以上，系统适用性良好。采用高效液相色谱法测定银蜜片中麦角甾醇的含量，经过精密度、稳定性、重复性、回收率试验考察，结果均符合要求。

3.2 提取方法考察

考察提取溶剂（甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇）、提取方法（回流、超声、索氏提取）、提取时间（3，4，5，6 h），最终确定最佳提取条件为70%甲醇索氏回流提取4 h。

3.3 结果分析

本试验中测定了3批银蜜片中麦角甾醇的含量，结果显示，不同批次银蜜片中麦角甾醇的含量差异较大，含量范围为 0.014 ～0.020 mg／g，平均值为 0.018 mg／g。以上数据可为增加银蜜片中麦角甾醇含量限度提供参考依据。

[1]林伯香，郑仪信.银蜜片鉴定会在福建三明召开[J].中国医院药学杂志，1984，4（4）:36.

[2]郑义信.新药银蜜片通过技术鉴定[J].中国药学杂志，1983，18（5）:21.

[3]周临深，曹清漪，王淑云，等.银蜜片治疗冠心病102例临床疗效分析[J].北京中医，1982，1(3):24 －26.

[4]WS3－B－1834－94，中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂(第九册)[S].

[5]邓玉清，王 纪，虞 龙.微生物麦角甾醇的研究进展[J].微生物学杂志，2001，21(3):45 －47.

[6]蔡鹏丽，何秀萍，刘 楠，等.甾醇C－22去饱和酶高表达对酵母细胞麦角甾醇合成的影响[J].微生物学报，2007，47(2):274－279.

[7]Reeslev M，Miller M，Nielsen KF.Quantifying mold biomass on gypsum board:comparison of ergosterol and beta－N－acetylhexosaminidase as mold biomass parameters[J].Applied and Environmental Microbiology，2003，69(7):3996 － 3998.

[8]Hirasawa M，Shouji N，Neta T，et al.Three kinds of antibacterial substances from Lentinus edodes(Berk.)Sing.(Shiitake，an edible mushroom)[J].International Journal of Antimicrobial Agents，1999，11(2):151 － 157.

[9]南春辉.麦角甾醇的研究进展[J].中国新技术新产品，2009(10):6－7.

[10]曹龙辉，李晓 ，赵文红，等.麦角甾醇的研究进展[J].中国酿造，2014，33(4):9－12.

Content Determination of Ergosterol in Yinmi Tablets by HPLC

Xu Li,Zhao Xiaoqin,Wen Yongsheng,Zhou Shiyu
(Chengdu Institute for Food and Drug Control,Chengdu，Sichuan,China 610045)

Objective To establish an HPLC method for content determination of ergosterol in Yinmi Tablets.Methods The chromatographic column was Agilent Eclipse plus C18column(250 mm × 4.6 mm,5 μm)with methanol－ water(93 ∶7)as the mobile phase,the flow rate was 1.0 mL ／min,the detection wavelength was 283 nm and the column temperature was 35 ℃ .Results The linearity of ergosterol were good in the range of 0.09 －1.02 μg and the regression equation was Y＝1 508.708 1X ＋26.629 2(r＝0.999 8).The average recovery was 97.50%,and the RSD was 2.05%(n ＝ 9).Conclusion This method is simple,accurate,well sensitivity and reproducible,which can be used for the quality control of Yinmi Tablets.

Yinmi Tablets;ergosterol;content determination

R284.1；R286.0

A

1006－4931(2017)23－0026－03

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.23.008

许莉，女，主管中药师，研究方向为中药质量标准，（电子信箱）xulicd1987＠sina.com。

文永盛，男，副主任中药师，研究方向为中药质量标准，（电子信箱）cdwyscd＠163.com。

2017－08－16)