固相萃取－反相高效液相色谱法检测木瓜丸中双酯型生物碱限度

巩晓宇 ，陆燕萍，陈喜悦，邱凤邹 ，陈秋燕

（1.广东省深圳市龙岗区人民医院，广东 深圳 518172； 2.广东省深圳市大鹏新区妇幼保健院，广东 深圳 518120）

固相萃取－反相高效液相色谱法检测木瓜丸中双酯型生物碱限度

巩晓宇1，陆燕萍1，陈喜悦2，邱凤邹1，陈秋燕1

（1.广东省深圳市龙岗区人民医院，广东 深圳 518172； 2.广东省深圳市大鹏新区妇幼保健院，广东 深圳 518120）

目的 建立同时测定木瓜丸中3种双酯型生物碱含量的固相萃取－反相高效液相色谱（SPE－HPLC）法。方法 色谱柱采用Eclipse XDB － C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 m），流动相为 0.1%醋酸铵溶液(冰醋酸调 pH ＝3.5)－ 乙腈(75∶25)，流速为 1.0 mL ／min，检测波长为235 nm，柱温为 40 ℃。结果 新乌头碱、乌头碱、次乌头碱质量浓度分别在 1.25 ～ 12.5 g／mL，3.10 ～31.0 g／mL，3.24 ～32.4 g／mL范围内与峰面积线性关系良好；平均加样回收率为98.01%，RSD为1.50(n＝6)。结论 该方法快速简便，准确可靠，灵敏度高，可用于木瓜丸中3种有毒双酯型生物碱含量测定，以控制药品质量。

木瓜丸；双酯型生物碱；固相萃取；高效液相色谱法

木瓜丸为国家基本药物目录品种，具有祛风散寒、除湿通络、活络止痛的功效,主治寒湿闭阻所致的痹病，症见关节疼痛、肿胀、屈伸不利、局部畏恶风寒、肢体麻木、腰膝酸软。其由木瓜、当归、川芎、白芷、威灵仙、狗脊、牛膝、鸡血藤、海风藤、人参、制川乌、制草乌组方，方中制川乌、制草乌是主要有效成分，其中含新乌头碱、乌头碱、次乌头碱等有毒成分。在现有药材标准中，有针对这3种双酯型生物碱的限度检测[1]。为了保障临床用药安全，有必要制订该复方中这3种双酯型生物碱的检测方法。复方制剂中3种生物碱的含量比较低，目前对复方制剂中双酯型生物碱的检测主要采用毛细管电泳法、超高效液相色谱法、液相色谱－质谱连用法等，关于木瓜丸含量测定的高效液相色谱检测方法有很多[2－4]，经分析发现，常规的样品处理方法，杂质干扰严重，影响分析结果。本研究中采用固相萃取处理样品[5－6]，可去除样品中大部分干扰杂质，以达到净化样品的目的，提高含量分析的准确性，起到有效控制药品质量的作用，为进一步完善该药品的质量标准提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC－20A型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，包含真空在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、PDA检测器和化学工作站；AB204－N型电子分析天平（瑞士Mettler－Toledo公司）；650Y型超声波提取仪（上海比朗仪器制造公司）；Milli－Q型超纯水系统（Millipore公司）；固相萃取柱(迪马Pro Elut PSA，正相硅胶键合)。

1.2 试药

新乌头碱对照品（批号为110799－200404），乌头碱对照品（批号为110720－200410），次乌头碱对照品（批号为110798－200404），均购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用；木瓜丸[江西药都樟树制药有限公司，批号分别为 150206，150306，150401；葵花药业集团＜佳木斯＞有限公司(A公司),批号为201504013；广州白云山光华制药股份有限公司，批号为T40088；华润三九＜南昌＞药业有限公司，批号为1501077J；湖北广仁药业有限公司，批号分别为 150912，150909，151121；北京同仁堂科技发展股份有限公司（B公司)，批号为20150413；武汉太福制药有限公司（C公司)，批号分别为 T140031，T150188]。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Eclipse XDB －C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.1% 醋酸钠溶液（冰醋酸调 pH 至3.5） －乙腈（75∶25）；流速：1.0mL ／min；检测波长：235nm；柱温：40℃；进样量：10 μL。在此条件下的色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2.2 溶液制备

对照品溶液：分别取乌头碱对照品、次乌头碱对照品、新乌头碱对照品 6.1，15.5，16.2 mg，，精密称定，置100 mL容量瓶中，加异丙醇－三氯甲烷（1∶1）混合溶液定容，得混合对照品贮备液。精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，加异丙醇－三氯甲烷（1∶1）混合溶液定容至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液：取样品，粉碎，过三号筛，称取0.5 g，精密称定，加25 mL甲醇混匀，超声处理30 min，过滤，滤液经固相萃取小柱（使用前先活化：取甲醇和纯化水适量，交替淋洗），用25 mL甲醇冲洗固相萃取小柱，收集流出液，甲醇定容，置50 mL容量瓶中，即得。

2.3 方法学考察

精密度试验：按拟订色谱条件，取2.2项下混合对照品溶液，连续进样5次。结果3种双酯型生物碱色谱峰面积的 RSD 分别为 1.6% ，0.8% ，1.1%(n ＝ 5)，表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批(批号为150912)的样品6份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定。结果乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的 RSD分别为0.6%，0.9%，0.5%(n＝6)，表明方法重复性良好。

线性关系考察：精密量取混合对照品贮备液0.5，1.0，2.0，4.0，5.0 mL，置 25 mL 容量瓶中，用异丙醇 －三氯甲烷（1∶1）混合溶液定容至刻度，按拟订色谱条件进样检测，绘制标准曲线，以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归，得新乌头碱、乌头碱、次乌头碱的回归方程分别为 Y＝3.22×104X＋152.9（r＝ 0.999 2）， Y＝ 6.17 × 104X ＋ 93.7（r＝ 0.999 6），Y＝1.42×104X ＋245.1（r＝0.999 3）。结果表明，新乌头碱质量浓度在 1.25 ～ 12.5 μg／mL，乌头碱质量浓度 在 3.10 ～ 31.0 μg／mL， 次 乌 头 碱 质 量 浓 度 在3.24～32.4 μg／mL 范围内与峰面积线性关系良好。

稳定性试验：取同一供试品(批号为150912)溶液，分别于 0，1，4，8，24，48 h 时进样 10 μL，记录色谱图，测定峰面积。结果新乌头碱、乌头碱、次乌头碱的 RSD分别为 2.1% ，1.9% ，1.7%(n ＝ 6)，表明供试品溶液在48 h内稳定。

加样回收试验：取样品（批号为150912），精密量取0.5 g，共6份，置锥形瓶中，分别加入对照品溶液0.1 mL，按供试品溶液制备方法制备溶液并测定，以新乌头碱计算回收率。结果见表1。

表1 新乌头碱加样回收试验结果(n＝6)

2.4 样品含量测定

取不同批次样品，依法制备供试品溶液，按外标法测定含量。结果见表2。

表2 各批样品中双酯型生物碱的测定结果(n＝6， g／g)

3 讨论

3.1 样品处理方法选择

选择固相萃取[7－10]进行样品处理，结果发现固相萃取法能较好地提纯样品，杂质较少，相对于回流提取、萃取法，可更好地改善色谱图质量，提高分析的精密度和准确性。选择固相萃取方法，也考察过流出曲线图。以甲醇冲洗，每5 mL收集1份样品，分别进样，结果发现洗出液达到20 mL时，样品已基本洗脱完全，故供试品溶液中选择用25 mL甲醇洗脱基本能完全达到洗出的要求。

3.2 双酯型生物碱限度检测

木瓜丸中虽然投料制川乌、制草乌，但相对于饮片而言，其中双酯型生物碱含量极低，大部分样品中3种双酯型生物碱含量低于定量限，甚至低于检测限，建议限度标准采用峰面积总和与对照品总峰面积进行比对。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：181－182.

[2]赵排风，刘卫超.HPLC法测定木瓜丸中阿魏酸的含量[J].中国药事，2009，23(10)：1003－1004.

[3]姜 淑，彭永芳.高效液相色谱法测定木瓜中维生素C的含量[J].昆明学院学报，2009，31(6)：102 －103.

[4]唐维媛，董永刚，王明力，等.野木瓜中总黄酮的提取与含量测定[J].中国酿造，2008，21(20)：27 － 30.

[5]张秀蓝，张 烃，董 亮，等.固相萃取／液相色谱－串联质谱法检测医院废水中21种抗生素药物残留[J].分析测试学报，2012，31(4)：453 － 458.

[6]李艳霞，李 帷，张雪莲，等.固相萃取－高效液相色谱法同时检测畜禽粪便中14种兽药抗生素[J].分析化学，2012，41(2)：213－217.

[7]魏艳彪，钱丽颖，李永铿，等.大孔树脂对吡虫啉的吸附性能研究[J].食品工业，2011，33(1)：11 － 13.

[8]叶殷殷，曾元儿，曹 骋，等.不同型号大孔树脂分离大黄蒽醌类成分的研究[J].中成药，2011，33(1)：168 －170.

[9]盛华刚，朱立俏，林桂涛.壳聚糖澄清剂对枳实薤白桂枝汤颗粒提取液的纯化工艺研究[J].中国实验方剂学杂志，2010，16(4)：15 － 17.

[10]杨洁红，张宇燕，万海同，等.正交试验优选大孔树脂吸附纯化乌头碱工艺[J].中国药师，2008，11(12)：1415 －1417.

Determination of Diester Alkaloid Limit in Mugua Pills by SPE－HPLC

Gong Xiaoyu1,Lu Yanping1,Chen Xiyue2,Qiu Fengzou1,Chen Qiuyan1
(1.People′s Hospital of Longgang District,Shenzhen,Guangdong,China 518172; 2.Maternity and Child Healthcare Hospital of Shenzhen Dapeng New District,Shenzhen,Guangdong,China 518120)

Objective To establish an SEP－HPLC method for simultaneous determination of three kinds of diester alkaloids in Mugua Pills.M ethods The Eclipse XDB － C18column(250 mm × 4.6 mm,5 μm)was adopted,the mobile phase was 0.1% ammonium acetate solution(pH was adjusted to 3.5 by glacial acetic acid) － acetonitrile(75 ∶25),the flow rate was 1.0 mL ／min,the detection wavelength was 235 nm,and the column temperature was 40 ℃.Results The concentrations of new aconitine,aconitine and hypaconitine were in the range of 1.25 － 12.5 μg ／mL,3.10 － 31.0 μg ／mL,3.24 － 32.4 μg ／mL,the average recovery was 98.01% and RSD was 1.50%(n ＝ 6).Conclusion The method is rapid,simple,accurate,reliable and sensitive.It can be used to determine the contents of three toxic diester alkaloids in Mugua Pills and to control the quality of the drugs.

Mugua Pill;diester alkaloids;solid phase extraction;HPLC

R284.1；R286.0

A

1006－4931(2017)23－0017－03

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.23.005

广东省深圳市龙岗区科技发展资金医疗卫生（扶持类）项目[YLWS20150514153303078]。

巩晓宇(1983－)，女，硕士研究生，主管中药师，研究方向为中药资源与鉴定，（电子信箱）xiaoyu123126＠163.com。

2017－06－06)