高效液相色谱法测定金振口服液中6种成分含量

杨智慧 ，程 诚 ，姚 青

（1.江苏省连云港市药品检验所，江苏 连云港 222006； 2.江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001）

高效液相色谱法测定金振口服液中6种成分含量

杨智慧1，程 诚1，姚 青2

（1.江苏省连云港市药品检验所，江苏 连云港 222006； 2.江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001）

目的 建立测定金振口服液中黄芩苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、大黄素和大黄酚6种成分含量的高效液相色谱法。方法 色谱柱为Phenomenex C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 m），流动相为甲醇（A） －0.05% 磷酸溶液(B)，梯度洗脱，流速为 1.0 mL ／min，柱温为 30 ℃，波长切换时间序列采样（黄芩苷 0 ～15.0 min、280 nm，芦荟大黄素、大黄酸 15.0 ～35.0 min、254 nm，甘草酸 35.0 ～39.8 min、237 nm，大黄素、大黄酚 39.8～50.0 min、254 nm）。结果 黄芩苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、大黄素和大黄酚进样量分别在 0.043 2～2.162 5 g，0.012 8 ～0.638 0 g，0.018 5 ～0.926 0 g，0.035 8 ～1.792 5 g，0.049 8 ～2.488 0 g，0.052 9 ～2.643 5 g 范围内与峰面积线性关系良好，平均加样回收率 分别为 98.84% ，99.49% ，99.89% ，100.31% ，99.55% ，99.54% ， RSD 分别为 1.10% ，1.03% ，1.49% ，1.23%，0.98%，1.19%（n＝9）。结论 该方法简单快捷，准确可靠，可用于金振口服液的质量控制。

高效液相色谱法；金振口服液；黄芩苷；芦荟大黄素；大黄酸；甘草酸；大黄素；大黄酚

金振口服液收载于2015年版《中国药典(一部)》，由山羊角、平贝母、大黄、黄芩、青礞石、石膏、人工牛黄、甘草8味中药组方，具有清热解毒、祛痰止咳的功效[1]，主要用于小儿急性支气管炎的治疗。方中大黄含有多种蒽醌类化合物，具有泻下攻积、清热泻火的功效，主要成分为大黄素、芦荟大黄素、大黄酸等，用于实热积滞等症[2－6]；黄芩具有清热燥湿、泻火解毒的功效，主要成分为黄芩苷，用于湿温、暑湿等症[7－9]；甘草具有补脾益气、祛痰止咳的功效，主要成分为甘草酸、甘草苷，用于脾胃虚弱、倦怠乏力等症[10－11]。现行标准仅对黄芩中的黄芩苷以高效液相色谱（HPLC）法进行了含量控制。基于中药具有多组分、多靶点、协同作用的特点[12－14]，本研究中以黄芩苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、大黄素和大黄酚作为指标成分，采用HPLC法，通过波长切换法实现同时测定6种成分的含量，简单快捷，准确可靠，为该药品质量控制提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260型高效液相色谱仪，包括G－1311C型高压四元泵，G－1329B型自动进样器，G－1316A型柱温箱，G1315D型二极管阵列检测器（DAD）及 EZChrom Elite3.3.2.1037 色 谱 工 作 站 （ 美 国 Agilent公 司 ）；BP211D型电子天平（德国Sartorius公司）；SK250HP型超声仪（上海利导超声仪器有限公司）。

1.2 试药

黄芩苷对照品（批号为 110715－201318，纯度为93.3%），芦荟大黄素对照品（批号为 110795－201007，纯度为 98.0%），大黄酸对照品（批号为 110757－200206），甘草酸铵对照品（批号为 110731－200615），大黄素对照品（批号为110756－200110），大黄酚对照品（批号为 110796－201319，纯度为 99.6%），均购自中国食品药品检定研究院；金振口服液（江苏康缘药业股份有限公司，批号分别为 160721，160906，161108）；水为高纯水；磷酸（分析纯，北京化工厂，批号为160512）；甲醇(色谱纯，批号为160201)由Fisher Scientific提供；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A） －0.05% 磷酸溶液（B）梯度洗脱（0～12 min，48%A；12～15 min，48%A→65%A；15～40 min，65%A；40～45 min，65%A→48%A；45～50 min，48%A）；流速：1.0 mL ／min；检测波长：280 nm （0 ～ 15.0min，黄芩苷），254 nm （15.0 ～ 35.0 min，芦荟大黄素、大黄酸），237 nm（35.0 ～ 39.8 min，甘草酸），254 nm （39.8 ～50.0 min，大黄素、大黄酚）；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

混合对照品溶液：取各对照品适量，精密称定，加甲醇制成黄芩苷 432.5 μg ／mL，芦荟大黄素 127.6 μg ／mL，大黄素 185.2 μg ／mL，甘草酸 358.5 μg ／mL，大黄素497.6 μg ／mL，大黄酸 528.7 μg ／mL 的混合对照品贮备液，4℃贮存，备用。精密吸取上述贮备液5 mL置50 mL窬量瓶中，加甲醇稀释，定容，摇匀，即得混合对照品溶液。

供试品溶液：取样品（批号为161108）5支的内容物，混匀，精密量取10 mL，精密加入甲醇－盐酸（10∶1）混合液 90 mL，称定质量，超声（250 W，50 kHz）提取60 min，放冷，再称定质量，用甲醇 － 盐酸（10 ∶1）混合液补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：按处方比例分别称取除大黄、除黄芩和除甘草以外的其余中药材，按金振口服液的制备工艺分别制备缺大黄、缺黄芩和缺甘草的阴性样品，并按供试品溶液的制备及测定方法进行处理和测定。结果阴性样品溶液色谱中，在与供试品溶液色谱中黄芩苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、大黄素和大黄酚相应保留时间位置上未见色谱峰，说明其他药材对测定无干扰。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：取混合对照品贮备液 5，2，1，0.5，0.2，0.1 mL，分别置 10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制得6个质量浓度的系列混合对照品溶液，按拟订色谱条件进样测定。以对照品的进样量（X）为横坐标、峰面积值（Y）为纵坐标，进行线性回归，结果见表1。

表1 线性关系、定量限和检测限考察结果（n＝6）

检测限和定量限考察：将黄芩苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、大黄素和大黄酚的混合对照品溶液逐级稀释后进样分析，当信噪比(S／N)为10时，计算各成分定量限（LOQ），S／N为3时测定各成分检测限（LOD）。结果见表1。

精密度试验：精密量取同一混合对照品溶液10 μL，重复进样6次，分别测定其峰面积。结果黄芩苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、大黄素和大黄酚含量的 RSD分别为 1.36% ，0.98% ，1.28% ，1.15% ，0.96% ，1.19%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（批号为160721），按供试品溶液制备方法制备溶液，室温放置，分别于 0，1，3，5，8，12 h时进样10 μL，测定峰面积。结果黄芩苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、大黄素和大黄酚含量的 RSD分别为1.16% ，0.98%，1.13% ，1.40%，1.33% ，1.08%（n ＝6），表明供试品溶液在12 h内稳定。

重复性试验：精密量取同一批（批号为160721）样品，依法制备供试品溶液6份，测定含量。结果黄芩苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、大黄素和大黄酚的平均含量分别为 0.397 5，0.126 2，0.185 8，0.397 6，0.499 8，0.587 0 g／L， RSD 分 别 为 1.07% ，1.05% ，1.12% ，0.99%，1.15%（n ＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密量取已知含量的样品（批号为160906）内容物 5 mL，共 9份，每3份1组，分别精密加入上述混合对照品贮备液3 mL和甲醇－盐酸（10∶1）混合液92 mL，混合对照品贮备液5 mL和甲醇－盐酸（10∶1）混合液90 mL，混合对照品贮备液8 mL和甲醇－盐酸（10∶1）混合液87 mL，按拟订色谱条件进行测定，按外标法计算加样回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n＝9）

2.4 样品含量测定

依法对3批样品中的黄芩苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、大黄素和大黄酚含量进行测定。结果见表3。

表3 3批样品含量测定结果（g／L）

3 讨论

3.1 提取条件选择

[8]，比较了加热回流法、冷浸提取法和超声提取法3种方法，分别以甲醇、70%甲醇溶液、甲醇－盐酸（10∶1）混合液和甲醇 － 盐酸（10∶1）混合液为提取溶剂，分别提取 30，45，60，80 min，结果表明，甲醇 － 盐酸（10∶1）混合液超声提取60 min后黄芩苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、大黄素和大黄酚的提取效率最高。

3.2 流动相选择

有机相曾比较甲醇和乙腈，结果在相同梯度条件下使用甲醇作有机相，目标化合物能获得更好的分离效果。水相比较了0.1%磷酸溶液和0.05%磷酸溶液，结果表明，使用0.05%磷酸溶液作水相，目标化合物各色谱峰出峰时间适宜且分离度和峰形均明显优于0.1%磷酸溶液。

3.3 检测波长选择

根据黄芩苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、大黄素和大黄酚紫外吸收扫描结果，为进一步提高测定的灵敏度和准确性，本研究中采用了检测波长切换技术，选择在黄芩苷、芦荟大黄素、大黄酸、甘草酸、大黄素和大黄酚的最大吸收波长处进行检测，即280 nm（0～15.0 min，黄芩苷），254 nm（15.0 ～35.0 min，芦荟大黄素、大黄酸），237 nm（35.0 ～39.8 min，甘草酸），254 nm（39.8 ～50.0 min，大黄素、大黄酚）。

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Simultaneous Determination of 6 Components in Jinzhen Oral Solution by HPLC

Yang Zhihui1,Cheng Cheng1,Yao Qing2
(1.Lianyungang Institute for Drug Control,Lianyungang,Jiangsu,China 222006; 2.Jiangsu Kangyuan Pharmaceutical Company Limtied,Lianyungang,Jiangsu,China 222001)

Objective To establish an HPLC method for simultaneous determination of baicalin,aloeemodin,rhein,glycirrizic acid,emodin and chrysophanol in Jinzhen Oral Solution.Methods The chromatographic column was Phenomenex C18column(250 mm × 4.6 mm,5 μm),the mobile phase was methanol(A)－ 0.05% phosphoric acid solution (B)with gradient elution,the flow rate was 1.0 mL ／min,the column temperature was 30 ℃ ,the detection wavelength was 280 nm for baicalin(0－15.0 min),254 nm for aloeemodin and rhein(15.0 － 35.0 min),237 nm for glycirrizic acid(35.0 － 39.8 min),254 nm for emodin and chrysophanol(39.8 － 50.0 min).Results The linear range of baicalin,aloeemodin,rhein,glycirrizic acid,emodin and chrysophanol were 0.043 2 －2.162 5 μg,0.012 8 － 0.638 0 μg,0.018 5 － 0.926 0 μg,0.035 8 － 1.792 5 μg,0.049 8 － 2.488 0 μg,0.052 9 － 2.643 5 μg,respectively.The average recovery rates were 98.84%,99.49%,99.89%,100.31%,99.55%,99.54%,respectively,theRSDs were 1.10%,1.03%,1.49%,1.23%,0.98%,1.19%(n ＝ 9).Conclusion This method is simple and fast,which can be used for quality control of Jinzhen Oral Solution.

HPLC;Jinzhen Oral Solution;baicalin;aloeemodin;rhein;glycirrizic acid;emodin;chrysophanol

R284.1；R286

A

1006－4931(2017)23－0022－04

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.23.007

杨智慧，女，大学本科，研究方向为药物分析，（电话）0518－85836780（电子信箱）814120942＠qq.com。

2017－07－10；

2017－08－31)