甘草酸对巨噬细胞抗绵羊肺炎支原体感染的调控作用研究

高力扬，张 凯，王巧辉，裴佳瑞，马泽华，李 敏*

1宁夏大学生命科学学院 宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室；2宁夏大学新华学院，银川750021

绵羊肺炎支原体(Mycoplasmaovipneumoniae，MO)是引起绵羊、山羊传染性胸膜肺炎及增生性间质性肺炎的病原体，对宁夏滩羊养殖业危害较大。大环内酯类抗生素、泰乐菌素、红霉素及阿奇霉素等对绵羊支原体肺炎具有减缓病情的作用，但无法根治该病，而且易产生耐药性。以往研究发现支原体对机体有免疫抑制作用，主要体现在：促进巨噬细胞凋亡[1,2]，影响炎症因子表达[3,4]，抑制巨噬细胞自噬[5]。甘草酸提取于甘草根部，是甘草中最主要的活性成分，可溶于水，分子式为C42H62O16，可以水解为2分子葡萄糖醛酸和1分子甘草次酸。目前研究显示甘草提取物有抑菌能力[6,7]，增强鸡巨噬细胞吞噬和清除胞内沙门氏菌的能力[8]，对治疗病毒性肝炎[9]、抑制铜绿假单胞菌[10]、鸡混合艾美耳球虫感染的免疫调节有一定作用[11]，而且可以抑制猪嗜血支原体对红细胞的黏附[12]。然而甘草酸对天然免疫细胞的影响尚不明确，因此本研究聚焦甘草酸在巨噬细胞抗MO感染中发挥的作用，为利用增强天然免疫的方式来预防绵羊支原体肺炎提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

胎牛血清购自全式金公司，高糖DMEM、胰酶、PBS购自Hyclone公司；青霉素-链霉素双抗、马血清购自Solarbio公司；CCK-8细胞活性检测试剂盒、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天公司；mRNA提取试剂盒购自OMEGA公司；凋亡及自噬相关基因引物由Sangon Biotech公司合成；Real-time PCR相关试剂盒购自TaKaRa公司；Bad抗体、Bax抗体、肿瘤坏死因子(TNF-α)ELISA检测试剂盒、Western Blot显色剂、DMSO、NanoDrop 8000设备、QuantStudio 5设备购自Thermo Fisher公司；GAPDH购自北京义翘神州科技有限公司；支原体培养基基础、支原体肉汤培养基购自青岛海博生物技术有限公司；甘草酸使用PBS配制为12、1.2、120、12 μM浓度。全波段酶标仪购自美国BIO-RAD公司；CO2细胞培养箱购自日本SANYO公司；多模式微孔板检测仪购自PerkinElmer公司；流式细胞仪购自德国Sysmex公司。

1.2 甘草酸的配制

称取甘草酸粉末溶于温PBS中，涡旋震荡溶解后用0.22 μm的过滤器过滤，配制成终浓度为120 mM的甘草酸储存液，4 ℃保存。

1.3 实验分组

本实验一共分为对照组、甘草酸处理组、MO感染组、甘草酸/MO感染组。其中对照组及MO感染组分别加入与甘草酸处理组、甘草酸/MO感染组稀释前甘草酸储存液相同体积的PBS缓冲液作为参照。

1.4 细胞培养

小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7采用含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素混合液的高糖DMEM培养液于37 ℃，5% CO2培养箱中培养。1～2天进行传代处理，取生长状态良好的细胞进行后续实验。

1.5 CCK-8细胞活性检测

接种2 000～5 000个细胞悬浮于100 μL培养基中，接种于96孔板中，置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h，每孔加入10 μL CCK-8检测试剂，于培养箱内孵育1～4 h后用全波段酶标仪450 nm波长处测定吸光值。

1.6 Western blot

将各个分组中细胞裂解后采用BCA蛋白定量检测试剂盒检测蛋白浓度，配平后加入蛋白上样缓冲液金属浴100 ℃保持5 min。Bad、Bax、GAPDH一抗1∶1 000稀释，4 ℃下孵育12 h，二抗1∶10 000稀释后室温下孵育2 h后上机检测。

1.7 Real-time PCR

将各个分组中细胞裂解后采用mRNA提取试剂盒对细胞mRNA进行提取， NanoDrop 8 000进行浓度测定后利用反转录试剂盒反转录获取cDNA，按照TaKaRa Real-time PCR试剂盒说明利用QuantStudio 5设备对凋亡及自噬相关基因表达量进行测定。

1.8 ELISA

取各个分组细胞培养上清用于ELISA检测，TNF-α检测步骤参照试剂盒内说明书，酶标仪读取450 nm处OD值。

1.9 细胞周期检测

实验分为2组，分别为对照组和甘草酸处理组，培养24 h后收集细胞于1 mL预冷的70%乙醇中-20 ℃固定一夜。采用细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒处理两组细胞，然后用流式细胞仪检测细胞周期。

表1 Real-time qPCR引物序列Table 1 The Real-time qPCR primer sequences

1.10 MO培养

支原体培养基基础33 g溶解于1 L蒸馏水中，高压后冷却至室温，加入20%马血清、80万单位氨苄青霉素、1%醋酸铊10 mL，充分混匀后分装于50 mL离心管中，置于-20 ℃冰箱保存。Y98标准株培养于37 ℃，5% CO2培养箱中，待培养基颜色由红色变为橙黄色(pH6.8)左右时1∶5传代培养。MO浓度采用颜色变化单位测定法(colour change unit,CCU)计算，即十倍梯度稀释MO菌液后观察MO培养基颜色变化，以最后发生颜色改变的稀释倍数为待检的MO菌液的CCU。

1.11 甘草酸处理RAW264.7

将预先配置好的甘草酸储存液用新鲜的细胞培养液稀释到合适浓度，然后用稀释好的甘草酸对待处理细胞进行换液处理，空白对照组将所用甘草酸储存液相应体积的PBS用新鲜培养液进行同比稀释处理并对待处理细胞进行换液。

1.12 MO侵染RAW264.7

RAW264.7细胞对数生长时，以5×106的密度接种于10 cm细胞培养皿中，待细胞贴壁且生长状态良好，12 000 rpm，10 min离心收集MO并用新鲜细胞培养液将MO重悬后按感染复数MOI=10∶1加入待感染的细胞，并置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h后分别提取各个分组细胞的总蛋白及总mRNA进行后续实验。

1.13 统计学分析

统计学软件采用GraphPad Prism 7.04，两组数据之间采用T tests非参数检验法统计，三组及三组以上数据采用单因素方差分析法进行统计学分析。

2 结果

2.1 甘草酸对巨噬细胞RAW264.7的毒性检测

为了验证不同浓度甘草酸对巨噬细胞活性的影响，我们采用12、1.2、120、12 μM浓度的甘草酸-PBS溶液处理RAW264.7细胞，培养24 h后用CCK-8法检测细胞活性(图1)。结果显示与对照组相比浓度为120、12 μM的甘草酸显著提高RAW 264.7巨噬细胞活性(P<0.000 1，P=0.012 9)；而12、1.2 mM高浓度甘草酸与对照组相比显著抑制RAW264.7巨噬细胞存活(P<0.000 1)。因此本实验采用最小浓度12 μM甘草酸溶液处理细胞。

图1 筛选适合RAW264.7巨噬细胞的甘草酸处理浓度Fig.1 Optimal concentation for glycyrrhizic acid to treat RAW264.7 macrophages.注：(120 μmol/L)*** P <0.000 1 vs对照组；(12 μmol/L) * P=0.012 9 vs对照组；(12 mmol/L、1.2 mmol/L) *** P <0.000 1 vs对照组。Note：(120 μmol/L)*** P <0.000 1 vs Control；(12 μmol/L) * P=0.012 9 vs Control；(12 mmol/L、1.2 mmol/L) *** P <0.000 1 vs Control.

2.2 甘草酸对RAW 264.7巨噬细胞细胞周期的影响

图2为流式细胞仪检测甘草酸处理前后RAW264.7巨噬细胞周期，结果显示：与未处理组相比甘草酸处理后，处于G1期的细胞数量减少，S期细胞数量减少，G2期细胞数量增加。

2.3 甘草酸对受MO感染的RAW 264.7巨噬细胞细胞活性的影响

取CCU浓度为1×107生长良好的MO，按照 MOI值为10∶1感染RAW264.7细胞。实验分为无感染对照组，MO感染组，经甘草酸处理的MO感染组，分别培养24 h后检测细胞活性。结果显示与对照组相比24 h内MO没有显著抑制RAW264.7的生长(P=0.659 4)，加入甘草酸组中RAW264.7巨噬细胞增殖显著增加(P=0.021 7，图3)。

图2 甘草酸处理前后巨噬细胞周期。Fig.2 Cell cycle in non-treated and glycyrrhizic acid treated macrophages注：左侧为未处理组，右侧为甘草酸处理组。Note：The left side is the untreated group,and the right side is the glycyrrhizic acid treated group.

图3 甘草酸对受MO感染的RAW264.7巨噬细胞活性的影响。Fig.3 Effect of glycyrrhizic acid on cell viability of MO-infected RAW264.7 macrophages注：P=0.659 4 MO感染组 vs对照组； *P=0.021 7 甘草酸+MO组vs对照组。Note：P=0.659 4 MO treated vs Control; *P=0.021 7 glycyrrhizic acid+MO treated vs Control.

2.4 甘草酸调控MO感染后巨噬细胞中TNF-α的分泌

为了验证甘草酸对巨噬细胞炎症因子分泌的影响，本实验采用ELISA分析巨噬细胞上清液中的TNF-α的表达量(图4)。结果显示与对照组相比MO感染后巨噬细胞TNF-α的表达量显著下降(P<0.000 1)，而正常巨噬细胞在甘草酸处理后TNF-α的表达量也会显著降低(P=0.009 7)，但加入甘草酸的巨噬细胞被MO感染后，细胞上清中TNF-α表达量有所上升(P<0.05)。

2.5 甘草酸对受MO感染后巨噬细胞凋亡相关基因的表达的影响

为了研究MO对巨噬细胞凋亡的影响，以及甘草酸在此过程中的作用，本实验采用Real-time PCR法检测凋亡相关基因caspase 3、caspase 8、caspase 9的表达情况(图5)。结果显示，与Control组相比巨噬细胞中凋亡相关基因caspase 3的表达在MO感染后上调(P<0.000 1)，caspase 8无显著变化(P=0.347 9)，caspase 9表达量下调(P<0.000 1)。与MO组相比受MO感染的巨噬细胞中经甘草酸处理后caspase 3、caspase 8的表达量均显著下调(P<0.000 1)，caspase 9则无显著变化(P=0.424 6)。

图4 巨噬细胞培养上清中TNF-α的分泌Fig.4 Secretion of TNF-α in macrophage culture supernatant注： ***P <0.000 1 MO感染组 vs对照组；**P =0.009 7甘 草酸组 vs对照组；*P <0.05 MO感染组vs甘草酸+MO组。Note： ***P <0.000 1 MO treated vs Control；**P =0.009 7 glycyrrhizic acid treated vs Control； *P <0.05 MO treated vs glycyrrhizic acid+MO treated.

2.6 甘草酸对受MO感染后巨噬细胞凋亡相关蛋白的表达的影响

为了进一步研究MO对巨噬细胞凋亡的影响，以及甘草酸在此过程中的作用，本实验采用Western blot法检测凋亡蛋白Bax、Bad的表达情况(图6)。结果显示，与对照组相比巨噬细胞中促凋亡蛋白Bax的表达在MO感染后上调，而加入甘草酸处理不会引起正常巨噬细胞Bax蛋白的表达，但在受MO感染的巨噬细胞中，甘草酸不能改善MO引起的巨噬细胞Bax蛋白表达(P= 0.076 3)。Bad蛋白在正常巨噬细胞中弱表达，在MO处理组中无表达，但甘草酸处理组表达量较高(P<0.000 1)。

图5 凋亡相关基因在巨噬细胞中的表达情况。Fig.5 Expression of apoptosis-related genes in macrophages.注：(Caspase 3)***P <0.000 1；(Caspase 8)P =0.347 9；(Caspase 9)****P <0.000 1 MO组vs Control。 (Caspase 3、Caspase 8)****P <0.000 1；(Caspase 9)P =0.424 6 MO/甘草组vs MO组。Note：(Caspase 3)***P <0.000 1；(Caspase 8)P =0.347 9；(Caspase 9)****P <0.000 1 MO treated vs Control.(Caspase 3、Caspase 8)****P <0.000 1；(Caspase 9)P =0.424 6 MO/ glycyrrhizic acid treated vs MO treated.

图6 促凋亡因子在巨噬细胞中的表达情况。Fig.6 Expression of pro-apoptotic factors in macrophages.(A) images of Western blot results.(B) quanlitative analysis of bands by ImageJ software.注：(Bax)P = 0.076 3 MO组 vs甘草酸/MO组；(Bad)****P <0.000 1 对照组vs甘草酸。Note：(Bax)P = 0.076 3 MO treated vs MO/ glycyrrhizic acid treated；(Bad)****P <0.000 1 Control vs glycyrrhizic acid treated.

2.7 甘草酸对受MO感染后巨噬细胞自噬相关基因的表达的影响

为了研究MO对巨噬细胞自噬的影响，以及甘草酸在此过程中的作用，本实验采用Real-time PCR法检测自噬相关基因Atg 7、Beclin 1的表达情况(图7)。结果显示，与Control组相比受MO感染的巨噬细胞中经甘草酸处理后自噬相关基因Atg 7的表达量显著上调(P<0.000 1)，Beclin 1表达量显著上调(P=0.001 6)；与MO组相比MO/甘草酸组自噬相关基因Atg 7、Beclin 1的表达量均显著上调(P<0.000 1)。

3 讨论

研究结果显示，高浓度甘草酸溶液对细胞有抑制作用，但12 μmol/L甘草酸溶液可以促进RAW264.7巨噬细胞增殖。以往研究发现支原体感染可使巨噬细胞活力下降，感染后期巨噬细胞凋亡，从而破坏宿主免疫系统对原发感染和继发感染的控制，使得炎症得以扩散和蔓延[13]。甘草酸处理后细胞周期G1期、S期细胞数量减少，而进入G2期的细胞数量增加，结合细胞增殖检测，提示甘草酸可能通过调节细胞周期来促进巨噬细胞的细胞增殖，从而对巨噬细胞抗MO感染有一定积极作用。在细胞凋亡方面，caspase半胱氨酸蛋白酶家族引发的级联反应是介导细胞凋亡的中心环节，通过选择性地切割某些蛋白质使靶蛋白活化或失活，从而介导下游的细胞凋亡过程[14,15]。本实验验证了caspase家族的重要成员caspase 3，caspase 8，caspase 9在甘草酸参与的巨噬细胞应对MO感染中的作用。实验发现甘草酸可以抑制凋亡基因caspase 3、caspase 8、caspase 9在正常巨噬细胞中的表达。 蛋白检测发现促凋亡因子Bax表达在正常组和甘草酸处理组均无明显表达，而在MO处理后表达量明显升高，提示MO感染可能会引起巨噬细胞凋亡。实验结果提示甘草酸处理可以减少巨噬细胞凋亡因子的表达，从而增加MO处理后的巨噬细胞活性。

图7 自噬相关基因在巨噬细胞中的表达情况Fig.7 Expression of autophagy-related genes in macrophages注：(Atg 7)****P<0.000 1；(Beclin 1)**P =0.001 6 MO/甘草酸组 vs Control。(Atg 7、Beclin 1) ****P<0.000 1 MO/甘草酸组 vs MO组。Note：(Atg 7)****P<0.000 1；(Beclin 1)**P =0.001 6 MO/ glycyrrhizic acid treated vs Control.(Atg 7、Beclin 1) ****P<0.000 1 MO/ glycyrrhizic acid treated vs MO treated.

本课题组前期研究发现，MO可能通过抑制巨噬细胞自噬而减少巨噬细胞对MO的清除[5]。Bad蛋白在促凋亡和激活自噬中均发挥作用，本实验中Bad在正常组中表达，在甘草酸处理组中高表达，而在MO感染组中均无表达，提示甘草酸可能在激活巨噬细胞自噬中发挥作用。因此本实验对自噬相关基因进行验证。自噬基因Beclin 1 和Atg 7表达变化说明，正常情况下甘草酸处理和甘草酸处理后经MO感染情况下，都可以引起自噬相关蛋白编码基因的高表达，结果提示甘草酸可能对巨噬细胞自噬有一定正向调控作用。

巨噬细胞可吞噬病原微生物，放大炎症信号，并通过抗原递呈调节T细胞应答参与获得性免疫应答[16,17]。 TNF-α主要由活化的巨噬细胞产生，可以诱导T细胞及NK细胞增殖活化[18,19]，及促进单核细胞白血病细胞U937向巨噬细胞分化[20]，而且TNF-α能有效刺激肺泡上皮细胞A549产生过度炎症反应[21]。本实验发现MO可以抑制巨噬细胞分泌TNF-α，可能是MO对巨噬细胞免疫抑制的一个体现。然而甘草酸处理过的巨噬细胞在受到MO感染后，其TNF-α分泌量显著回升。

综上所述，甘草酸可以抑制受MO感染后巨噬细胞的凋亡，并且可以增加巨噬细胞增殖，而且甘草酸可以促进受MO感染的巨噬细胞分泌炎症因子TNF-α，除此之外，甘草酸可能通过对巨噬细胞自噬产生激活作用，从而在消除MO感染中发挥作用。