TLR2、TLR9及CD19、CD23在儿童传染性单核细胞增多症中的表达及意义

母发光，王 强，郑 佳，房 俊

(四川省医学科学院·四川省人民医院 a.儿科；b.医学实验中心，四川 成都 610072)

TLR2、TLR9及CD19、CD23在儿童传染性单核细胞增多症中的表达及意义

母发光a，王 强a，郑 佳a，房 俊b

(四川省医学科学院·四川省人民医院 a.儿科；b.医学实验中心，四川 成都 610072)

目的了解传染性单核细胞增多症(infectious mononucleosis，IM)患儿不同时期外周血单个核细胞TLR2、TLR9 mRNA和 CD19、CD23的表达情况及其变化规律，探讨其在发病中的作用。方法回顾性分析2015年4月至2016年2月30例我院确诊为IM患儿的临床资料。新诊断IM的30例患儿为IM急性期组，其中26例(失访4例)经治疗临床症状体征消失，病程满1个月为IM恢复期组，同期常规体检健康的24例儿童为对照组。采用SYBRGreen I 实时荧光定量PCR方法检测外周血单个核细胞TLR2 mRNA、TLR9 mRNA的表达。采用流式细胞术检测外周血单个核细胞中B细胞CD19+和永生B细胞CD19+CD23+的阳性表达率。结果IM患儿急性期CD19+及CD19+CD23+表达阳性率低于恢复期 (P< 0.05)，且急性期和恢复期表达阳性率均低于对照组(P< 0.05)。急性期TLR2 mRNA、TLR9 mRNA表达水平高于恢复期 (P< 0.05)，且急性期和恢复期表达水平均高于对照组(P< 0.05)。结论TLR2、TLR9，CD19+CD23+、 CD19+在IM不同时期通过对免疫细胞的调节可能参与了IM发病。

传染性单核细胞增多症；Toll受体2；Toll受体9；CD19；CD23；儿童

儿童时期感染 EB 病毒后表现形式多种多样，可无明显临床症状而仅表现为病毒携带者，或仅有发热、咽炎等轻微临床症状，传染性单核细胞增多症(Infectious mononucleosis，IM)，是常见的感染形式，进一步可表现为EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)相关性嗜血细胞综合症、淋巴瘤、慢性活动性EBV感染等，临床症状重，可伴有多器官损害等严重并发症[1]。但发病机制尚未完全清楚，如何在感染后及时评估患儿的预后，以期早期干预，避免其向重症发展值得关注。CD19的阳性表达(CD19+)即为B细胞，CD19和CD23均阳性表达(CD19+CD23+)即为永生B细胞。B细胞是EB病毒感染的最初靶细胞，也是EBV在体内建立持续感染的终身潜伏场所[2]。Toll样受体(TLRs)参与免疫系统对EBV的识别，同时在EBV感染及其转归中起重要作用[3]。本研究观察30例IM患儿不同时期外周血单个核细胞TLR2、TLR9 mRNA，B细胞CD19+和永生B细胞CD19+CD23+的表达情况及变化规律，以探讨其在发病中的作用。

1 资料与方法

1.1一般资料选取2015年4月至2016年2月在四川省人民医院儿科住院新诊断为IM患儿30例(IM急性期组)，男 18 例，女12例，年龄2～14岁(6.5±2.5)岁，研究对象均符合IM诊断标准[4，5]。IM恢复期组： IM急性组患儿经治疗临床症状体征消失，病程满1个月时复查，26例(失访4例)。对照组：我院儿童保健门诊同期常规体检健康儿童24例，男 10例，女12例，年龄3～14岁(6.3±2.0)岁，检测其血清EB病毒衣壳抗原IgM和IgG抗体均为阴性(EBVCA-IgM、IgG阴性)。各组儿童家长均知情同意，试验经我院伦理委员会审查通过。三组儿童年龄、性别分布差异无统计学意义(P< 0.05)。

1.2方法①血液样本收集：抽取IM患儿分别在急性期(发病<7天)，病程1月和健康体检对照组儿童，外周静脉血4 ml注入BD肝素锂抗凝真空采血管中，立即送检。采用聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)备用。剩余血标本1000 r/min离心5 min，分离上层血浆分装至EP管，-80 ℃冰箱保存；提取血浆后剩余血细胞加等量PBS用于提取RNA，合成cDNA，制备实时荧光定量 PCR检测样本。②仪器与试剂：美国 Beckman Coulter公司Cytomics FC500型流式细胞仪。美国 ABI 公司7900 hT Fast Real-Time PCR System型实时荧光定量PCR 仪。引物由上海生物工程技术公司合成。1-15K，CD23-FITC(异硫氰酸荧光素)和CD19-PE(藻红蛋白)鼠抗人荧光单克隆抗体购自美国Beckman Coulter公司。Trizol试剂盒购自美国 Invitrogen 公司，逆转录试剂盒购自美国ABI公司，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒购于大连宝生物工程有限公司。③CD19+CD23+，CD19+表达的检测：分别取CD19，CD23单抗各10 μl，加入抗凝血50 ml混匀，避光孵育20分钟，加入红细胞裂解液，在流式细胞仪上计数4000个以上的淋巴细胞，分别记录CD19+CD23+，CD19+的阳性表达率。④总RNA提取：转速10000～12000 r/rain离心样本，用Trizol试剂提取上述分离的PMBC总RNA，紫外分光光度计测定RNA含量。⑤cDNA制备：用逆转录试剂盒，取 2 μg 总 RNA 合成cDNA，反应体积为20 μl，逆转录条件： 25 ℃10 min，37 ℃ 120 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ forever。制成的 cDNA-20 ℃条件下保存备用。⑥实时荧光定量 PCR检测：引物序列设计如下：TLR2(80bp)上游引物序列：5'-ATTGTGC-CCATTGCTCTTTC-3'，下游引物序列： 5'-CTTCC TTG-GAGAGGCTGATG-3；TLR9(194bp)上游引物序列：5'-CAGGGACAACCACCACTTC T-3'，下游引物序列：5'-AGC-CTT-CGG-TA G-CAT-TTA-TTG-3'。内参基因hGAPDH(226bp)上游引物序列5'-GAAGGTGAAG-GTCGGAGTC-3'，下游引物序列5'-GAAGATGGT-GATGG GATTTC-3'。采用SYBR Premix Ex Taq TMⅡ试剂盒，使用PCR扩增仪，进行SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR扩增。以参照基因作为标准进行相对定量的△Ct 法计算目的基因的相对表达量。

1.3统计学方法采用 SPSS 16.0统计学软件包进行数据处理。计量资料以均数±标准差表示，对所有数据进行方差齐性检验，多组样本均数间比较用采用One-Way ANOWA方差分析，进一步组间两两比较用LSD法。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

三组IM患儿CD19+及CD19+CD23+表达阳性率总体差异有统计学意义 (P<0.01)，急性期表达阳性率低于恢复期 (P< 0.05)；急性期和恢复期表达阳性率均低于对照组(P< 0.05)。IM患儿TLR2 mRNA、TLR9 mRNA相对表达水平在三组总变异率比较，差异有统计学意义 (P<0.01)，组间两两比较显示：急性期表达水平高于恢复期 (P< 0.05)，急性期和恢复期表达水平均高于对照组(P< 0.05)。见表1。

表1 三组儿童CD19+、CD19+CD23+表达阳性率及TLR2 mRNA、TLR9 mRNA相对表达水平比较

a与b比较，a与c比较，b与c比较，均P< 0.05

3 讨论

IM是原发EBV感染的一种常见形式，B细胞成为原发EBV感染最初靶细胞平[6]。当机体免疫力正常时，T细胞及NK细胞对感染B细胞的杀灭，大多数EBV被清除，病情常表现为自限性、预后良好。但EBV感染B细胞可逃避免疫监视，并建立持续性感染B细胞库，在T细胞缺乏或T细胞功能不足时这种永生B细胞可不断增殖、在体内建立持续感染的潜伏场所[7]。CD19分子是B细胞表面相对分子质量为95000的糖基化I型跨膜蛋白。CD19分子的表达在骨髓B祖细胞即开始，持续于整个B细胞成熟期，，其表达水平代表B细胞水平[8]。CD23是一种相对分子质量为45000的II型跨膜糖蛋白，主要表达于激活的B细胞表面，是B细胞激活标志之一，CD23的持续表达，代表了B细胞的永生化。测定外周血单个核细胞CD19+CD23+及CD19+表达水平，可反映B细胞及永生B细胞水平[9，10]。

Toll样受体(TLRs)作为一种跨膜信号传递受体，是先天性免疫模式识别受体的重要组成部分，在识别病原微生物、触发天然免疫和影响获得性免疫中发挥着重要作用，使免疫系统迅速抵抗病原微生物感染的感染[11，12]。其中TLR2是所有TLRs家族亚类中的代表性受体，是抗感染免疫反应中最直接的模式识别受体。存在于细胞表面，几乎表达于所有的细胞系，在所有的TLRs中，TLR2识别的配体最多，通过 TLR2 信号途径，EBV能特异地激活免疫细胞，产生炎性因子发挥病理损害作用[13，14]。EBV衣壳蛋白通过TLR2的配体诱导单核-巨噬细胞高表达TLR2，TLR2激活单核细胞产生趋化蛋白-1等炎性因子，从而参与参与抗EBV的免疫反应。TLR9主要表达于免疫细胞，如记忆性B细胞和浆细胞样树突状细胞，定位于胞内内质网，识别特定的病原相关细菌或病毒的非甲基化 CpG-DNA 序列，介导髓样分化因子88(MyD88)依赖型信号传导通路，激活多种细胞因子的基因转录，启动免疫应答，调节病毒的增殖和复制[15]。EBV在抗病毒的免疫反应中，通过增强免疫细胞表达TLR9，促进免疫细胞产生抗病毒细胞因子(如 IFN-α，IFN-β)，发挥宿主抗EBV的作用[16]。本研究结果显示，在TM急性期，TLR2、TLR9 mRNA表达水平上调，CD19+CD23+及CD19+表达阳性率明显降低(P< 0.05)。恢复期，TLR2、TLR9 mRNA表达水平下调，CD19+CD23+及CD19+表达阳性率明显增高(P< 0.05)，急性期和恢复期与对照组比较差异均具有统计学意义(P< 0.05)。其免疫机制为：EBV感染触发TLRs表达，并影响感染EBV的B细胞增殖。在IM的急性期，TLR2通过机体的固有免疫反应，限制EB病毒的传播和表达[17]。TLR9识别EBV病毒并限制其传播并控制已被病毒感染的潜伏B细胞而发挥作用[18]。EBV感染的急性期触发TLR2、TLR9 mRNA表达上调以识别病原体，并将病原体交予抗原提呈细胞，引发机体免疫反应，杀灭过多的感染EBV的B细胞，导致急性期CD19+、CD19+CD23+水平降低。该过程有利于宿主免疫系统对病毒的清除，避免永生B细胞的过度增殖，而不至于转化为肿瘤细胞[19]。在疾病恢复期，EBV清除后，TLR2、TLR9的配体对TLR2、TLR9的刺激减弱。因此，恢复期TLR2、TLR9 mRNA的表达下调，EBV干扰TLRs的识别表达和功能，宿主免疫反应减弱，CD19+、CD19+CD23+水平逐渐增高，病毒处于暂时稳定状态，避免机体遭受过度免疫反应的损伤[20]。

由此可见：在IM病程的不同时期TLR2、TLR9，CD19+、CD19+CD23+通过对免疫细胞的调节影响EBV在感染免疫的急性期和恢复期平衡关系从而参与IM发病。

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ExpressionsandsignificanceofTLR2，TLR9，CD19andCD23inchildrenwithinfectiousmononucleosis

MUFa-guanga，WANGQianga，ZHENGJiaa，FANGJunb

(a.DepartmentofPediatrics，b.MedicalExperimentCenter，SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu610072，China)

ObjectiveTo investigate the expressions and variations of TLR2，TLR9，CD19 and CD23 in peripheral blood mononuclear cells of children with infectious mononucleosis (IM)，and to explore their role in the pathogenesis of the disease.MethodsThe clinical data of 30 newly diagnosed IM from April 2015 to February 2016 in our hospital were retrospectively analyzed.The 30 cases were taken as IM acute group.Among them，26 cases whose clinical signs and symptoms disappeared after treatment (4 cases lost follow-up) and course of disease lasted for about 1 month were taken as IM recovery group.Meanwhile，24 children with normal physical examination were taken as control group.The expressions of TLR2 mRNA and TLR9 mRNA in peripheral blood mononuclear cells was detected by SYBR Green I real-time fluorescence quantitative PCR.Flow cytometry was used to detect the positive expression rates of B cells (CD19+) and immortalized B cells (CD19+CD23+) in the peripheral blood mononuclear cells.ResultsThe positive expression rate of CD19+and CD19+CD23+in the acute period of children with IM was lower than that in the recovery period (P< 0.05)，and the positive rate of expressions in acute period and recovery period were lower than that in control group (P< 0.05).The expression levels of TLR2 mRNA and TLR9 mRNA in acute period was higher than that in recovery period (P< 0.05)，and the expression levels in acute period and recovery period were higher than that in control group (P< 0.05).ConclusionTLR2，TLR9，CD19 and CD23 may play an important role in the pathogenesis of IM in different stages.

Infectious mononucleosis；TLR2；TLR9；CD19；CD23；Child

R512.7

A

1672-6170(2017)06-0192-04

2017-03-07；

2017-04-17)