四种蔬菜食用器官提取物对植物组培污染细菌的抑制作用

李 白，高广春，方 琪，李 军，*

(1.浙江省嘉兴市农业科学研究院(所)，浙江 嘉兴 314016； 2.嘉兴学院 医学院，浙江 嘉兴 314001)

四种蔬菜食用器官提取物对植物组培污染细菌的抑制作用

李 白1，高广春2，方 琪2，李 军1，*

(1.浙江省嘉兴市农业科学研究院(所)，浙江 嘉兴 314016； 2.嘉兴学院 医学院，浙江 嘉兴 314001)

以生姜、洋葱、大蒜和苦瓜的食用器官为提取材料，分别用热水浸提、水超声提取、乙醇超声提取和挥发油提取的方法获得植物粗提物，探讨这些提取物对组培生产中污染细菌的抑制作用。抑菌试验结果表明，4种植物粗提物对分离的组培污染细菌均有一定的抑制效果，单种植物提取物不能抑制试验中所有细菌，不同提取方法获得的粗提物抑菌效果也有差别。热水浸提、水超声提取和乙醇超声提取方法中，乙醇超声提取物抑菌效果较好。大蒜和生姜挥发油对假单胞菌属(B2)及肠杆菌属(B11)菌株有显著抑菌效果，而其他提取方法无显著效果。最小抑菌浓度(MIC)结果表明，大蒜乙醇超声提取物MIC值较其他提取物低，生姜和大蒜挥发油效果较好，其对应的鲜质量也较高。这一结果可为植物组培污染菌的防治提供参考。

植物提取物；组织培养；细菌；最小抑菌浓度

植物组织培养的污染问题是影响组培生产的最大障碍之一，它直接影响生产成本和珍贵外植体材料的保全。植物组培污染微生物主要为细菌和真菌，其中细菌占50%以上，主要为芽孢杆菌属和假单胞杆菌属[1]。为控制细菌污染，除在组织培养操作过程中控制人为及环境因素外，在培养基中添加抗生素等抑菌剂也是常用的手段。然而，抗生素的药物残留及环境污染问题，尤其是在食用材料组织培养中的添加，一直是极具争议的问题。

植物源抑菌剂易降解，靶生物不易产生抗性，对人畜等非靶标生物毒性低，符合现代农业发展要求，在替代抗生素及减少抗生素应用方面具有很大应用价值，近年来成为国内外研究的热点[2-6]。目前，植物源抑菌剂在植物上的应用主要侧重于对植物病原真菌的防治，对植物组培污染防治方面的研究较少。崔刚等[7]在国内较早采用植物提取液作为抑菌剂，开展开放组培的研究，建立了葡萄茎段的开放组培体系，获得的组培苗根系较传统方式发达。张薪薪[8]比较了5种中草药提取物对植物组培污染菌的抑制作用，发现苦参提取物对细菌的抑制作用最强。陈瑞丹等[9]以植物源混合粗提液作为抑菌剂，初步建立了梅花茎段的开放式启动培养体系。在组培过程中，植物源抑菌剂毒副作用小，抗菌的同时可以确保安全，在控制植物组培污染方面具有较大应用价值[10]。

为研究植物源抑菌剂对植物组培污染细菌的抑制作用，本研究以生姜、洋葱、大蒜及苦瓜4种蔬菜的食用器官为材料，采用不同的提取方法获得植物提取物，研究不同植物及不同提取方法获得的提取物对组培生产中污染细菌的抑制效果，筛选有效的植物源抑菌剂。

1 材料与方法

1.1 试验材料

植物组培污染细菌采集自嘉兴中瑞生物科技有限公司植物组培间，由本实验室分离鉴定后，-80 ℃保存，供试细菌菌株见表1。大蒜、苦瓜、生姜、洋葱于超市采购。

表1植物组培污染细菌

Table1Pollution bacteria in plant tissue culture

编号No.细菌菌属Bacteriagenera菌株颜色ColorofstrainsB1类芽孢杆菌属Paenibacillus黄绿色Yellow-greenB2假单胞菌属Pseudomonas黄绿色Yellow-greenB3不动杆菌属Acinetobacter黄绿色Yellow-greenB4假单胞菌属Pseudomonas黄色YellowB5芽孢杆菌属Bacillus橙色OrangeB6芽孢杆菌属Bacillus黄绿色Yellow-greenB7寡养单胞菌属Stenotrophomonas黄绿色Yellow-greenB8芽孢杆菌属Bacillus黄色YellowB9芽孢杆菌属Bacillus黄色YellowB10埃希氏菌属Escherichia黄绿色YellowB11肠杆菌属Enterobacter黄绿色Yellow-GreenB12假单胞菌属Pseudomonas黄色Yellow

1.2试验方法

1.2.1 提取物制备

水超声提取：取新鲜大蒜鳞茎、苦瓜果实、生姜根茎、洋葱鳞茎，分别切碎后加适量纯水，用闪式提取器处理(80 V，2 min)；40 KHz 100 W超声处理30 min，处理液3 000g离心10 min，沉淀加100 mL纯水重复超声处理30 min，合并上清液；80 ℃浓缩至稠浸膏，称量，4 ℃保存。

乙醇超声提取：提取方法同水超声处理，提取溶剂为80%乙醇。

热水浸提：取新鲜大蒜鳞茎、苦瓜果实、生姜根茎、洋葱鳞茎，分别切碎后加适量纯水，用闪式提取器处理(80 V，2 min)；沸水浴回流提取2 h，处理液3 000g离心10 min，取上清液；80 ℃浓缩至稠浸膏，称量，4 ℃保存。

挥发油提取：取新鲜大蒜鳞茎、苦瓜果实、生姜根茎、洋葱鳞茎，分别切碎后加适量纯水，用闪式提取器处理(80 V，2 min)；转入500 mL圆底烧瓶中，利用挥发油提取装置，提取收集挥发油，计量，4 ℃保存。

水超声提取、乙醇超声提取及热水浸提物用纯水溶解配置成10%(m/V)抑菌剂，挥发油用0.5% tween-20配置成1%(V/V)抑菌剂。抑菌剂均用0.22 μm滤膜过滤除菌。提取物种类见表2。

表2提取物种类编号

Table2No. of plant extracts

编号No.植物材料Plantmaterial提取方法Extractionmethod编号No.植物材料Plantmaterial提取方法ExtractionmethodGa1大蒜Garlic水超声提取UltrasonicwaveextractionwithwaterGi1生姜Ginger水超声提取UltrasonicwaveextractionwithwaterGa2大蒜Garlic热水浸提HotwaterextractionGi2生姜Ginger热水浸提HotwaterextractionGa3大蒜Garlic乙醇超声提取UltrasonicwaveextractionwithethanolGi3生姜Ginger乙醇超声提取UltrasonicwaveextractionwithethanolGa4大蒜Garlic挥发油提取VolatileoilextractionGi4生姜Ginger挥发油提取VolatileoilextractionOn1洋葱Onion水超声提取UltrasonicwaveextractionwithwaterGo1苦瓜Bittergourd水超声提取UltrasonicwaveextractionwithwaterOn2洋葱Onion热水浸提HotwaterextractionGo2苦瓜Bittergourd热水浸提HotwaterextractionOn3洋葱Onion乙醇超声提取UltrasonicwaveextractionwithethanolGo3苦瓜Bittergourd乙醇超声提取UltrasonicwaveextractionwithethanolOn4洋葱Onion挥发油提取VolatileoilextractionGo4苦瓜Bittergourd挥发油提取Volatileoilextraction

1.2.2 抑菌活性测定

牛津杯法测定抑菌活性：牛津杯规格Φ7.8 mm×6.0 mm×10.0 mm(外径×内径×高)，121 ℃高压灭菌，烘干冷却备用。将组培污染细菌(表1)分别涂布在固体LB培养基表面，每个平皿含有200 μL 106cfu·mL-1测试细菌。将牛津杯放入各个培养基表面，取抑菌剂溶液(表2)200 μL加入牛津杯，30 ℃培养48 h。每组3个重复，测定抑菌圈直径大小，取平均值。

液体倍比稀释法测定最低抑菌浓度(minimum inhibition concentration, MIC)：将抑菌剂用LB液体培养基分别稀释成2×、4×、8×、16×、32×、64×浓度，终体积为2 mL，用2 mL LB液体培养基作阳性对照，2 mL 2×稀释浓度抑菌剂作阴性对照。取对数生长期污染细菌悬液40 μL加入倍比稀释培养基及阳性对照培养基，30 ℃、120 r·min-1培养24 h。每组设3个重复，以完全没有菌生长的最低提取物浓度为最低抑菌浓度(MIC)。

2 结果与分析

2.1 植物提取物制备

提取物制备结果(表3)表明，生姜、洋葱、大蒜和苦瓜4种植物中，大蒜粗提浸出物最多，洋葱提取物次之，生姜提取物最少，大蒜提取物质量达到生姜提取物的10倍。乙醇超声提取方法最好，提取效果好于水超声提取，浸出物质量最大，200 g大蒜样品通过乙醇超声提取可获得55.20 g提取物。挥发油提取中，大蒜和生姜均获得少量植物精油，本试验未从洋葱和苦瓜中获得植物精油，其挥发物溶解于水相中。

表3植物粗提物的提取效果

Table3Extraction effect of crude extracts from plants

植物Plants水超声提取Ultrasonicwaveextractionwithwater提取物质量Extractweight/g1mL10%抑菌剂含鲜质量Freshweightin1mL10%bacteriostaticagent/g乙醇超声提取Ultrasonicwaveextractionwithethanol提取物质量Extractweight/g1mL10%抑菌剂含鲜质量Freshweightin1mL10%bacteriostaticagent/g热水浸提Hotwaterextraction提取物质量Extractweight/g1mL10%抑菌剂含鲜质量Freshweightin1mL10%bacteriostaticagent/g挥发油提取Volatileoilextraction挥发物体积Volatilevolume/mL1mL1%抑菌剂含鲜质量Freshweightin1mL1%bacteriostaticagent/g大蒜Garlic37.420.5355.200.3643.370.461.258.00生姜Ginger3.715.395.483.653.865.180.8511.76洋葱Onion12.271.6317.711.1315.381.3038.002.63苦瓜Bittergourd5.833.435.293.785.143.8921.004.76

注：热水浸提、水超声提取、乙醇超声提取各样品鲜质量均为200 g，挥发油提取各样品鲜质量均为1 000 g

Note: Fresh weight of all the samples extracted by hot water extraction， ultrasonic wave extraction with water or ethanol were 200 g， and fresh weight of all the samples extracted by volatile oil were 1 000 g

2.2 提取物抑菌活性

提取物抑菌活性测定时，水超声提取、乙醇超声提取及热水浸提物配制成10%(m/V)浓度，挥发油配制成1%(V/V)浓度；由于大蒜提取物最多，具有抑菌活性的抑菌剂含鲜质量也最低(表3)。4种植物粗提物抑菌活性测定结果(表4)表明，大蒜乙醇超声提取物、生姜乙醇超声提取物、洋葱乙醇超声、洋葱热水浸提物、苦瓜水超声提取物、苦瓜乙醇超声提取物对4株芽孢杆菌属菌株具有较强抑制效果；生姜热水浸提物、洋葱乙醇超声提取物对2株假单胞菌属菌株具有较强抑制效果；洋葱提取物、苦瓜超声提取物、生姜挥发油、大蒜挥发油对2株肠杆菌属菌株具有较强抑菌效果。B1、B2、B3、B7菌株对4种植物提取物敏感性均较低。4种植物中，洋葱提取物能有效抑制5种细菌生长，包括3种芽孢杆菌属菌株、1种假假单胞菌、1种肠杆菌。生姜挥发油、大蒜挥发油对假单胞菌属(B2)及肠杆菌属(B11)细菌有显著抑菌效果，而其他粗提物的抑菌效果不显著。图1为部分植物提取物的抑菌效果。

2.3最低抑菌浓度测定

根据提取物抑菌活性结果，选取4种植物乙醇超声提取物及生姜挥发油、大蒜挥发油，测定抑制效果较好的细菌菌株的MIC。结果(表5)表明，大蒜和生姜挥发油的MIC值最低，在稀释倍数分别为1 600倍[浸出物0.0625%(V/V)，鲜质量含量0.5 g·mL-1]和800倍[浸出物0.125%(V/V)，鲜质量含量1.47 g·mL-1]时，对肠杆菌属B5仍具有抑菌效果，较低稀释倍数下对其他试验菌株也有一定抑制效果。若以鲜质量为参考标准，则大蒜粗提物MIC值较低，稀释倍数为40倍(浸出物0.025 g·mL-1，鲜质量含量0.12 g·mL-1)和20倍(浸出物0.05 g·mL-1， 鲜质量含量0.23 g·mL-1)时，分别对B8、B6和B9具有抑制作用。与挥发油MIC值相比，生姜、大蒜、洋葱乙醇超声提取物的MIC值较高，原因可能是挥发油提取物样品的浓缩倍数高，且挥发油中含有的化合物抑菌作用较强。比较MIC与抑菌活性试验结果可知，除洋葱外，其他抑菌剂MIC与抑菌活性试验结果较一致，而洋葱乙醇超声提取物在抑菌活性试验中具有较强的抑菌效果，但在MIC试验中，抑菌效果达不到预期，这可能与培养基的物理形态改变有关，尚需进一步研究。图2为Go3提取物对B1菌株最低抑菌浓度的测定。

表4植物提取物的抑菌活性

Table4Antibacterial activity of plant extracts

菌株Bacterialstrains提取物抑菌活性AntibacterialactivityofplantextractsGa1Ga2Ga3Ga4Gi1Gi2Gi3Gi4On1On2On3On4Go1Go2Go3Go4B1-----+---------+B2-------+--------B3----++----+--++-B4-----++--+-------B5--++++++---++++++-----B6-+++---++--+++++++-++---B7----+--++-------B8--++---+++++++--++-B9+--++---+--++-+-++-B10--+-----++++++++++++-++B11---++---++--------B12+---------+++--+--

“-”，抑菌圈直径<9 mm，不敏感；“+”，抑菌圈直径9～10 mm，轻度敏感；“++”，抑菌圈直径10～15 mm，中度敏感；“+++”，抑菌圈直径15～20 mm，高度敏感；“++++”，抑菌圈直径>20 mm， 极敏感。

“-”， Diameter of inhibition zone is less than 9 mm， insensitivity； “+”， Diameter of inhibition zone is 9-10 mm， slight sensitive; “++”， Diameter of inhibition zone is 10-15 mm， moderately sensitive; “+++”， Diameter of inhibition zone is 15-20 mm， highly sensitive; “++++”， Diameter of inhibition zone is more than 20 mm， extremely sensitive.

B6、B11及B3为分离到的植物组培污染细菌，详见表1；On2、Gi4及Go1为植物提取物，详见表2B6， B11 and B3 were bacteria isolated from plant tissue culture， as shown in Table 1; On2， Gi4 and Go1 were plant extracts， as shown in Table 2图1 部分植物提取物的抑菌效果Fig.1 Bacteriostatic effect of partial plant extracts

表5提取物对部分菌株的最低抑菌浓度

Table5Minimum inhibitory concentration of plant extracts against to partial bacterial strains g·mL-1

菌株Bacterialstrains植物提取物最低抑菌浓度MinimuminhibitoryconcentrationofplantextractsGa3Ga4Gi3Gi4On3Go3B1—————0.025(0.97)B5—0.000625(0.50)—0.00125(1.47)——B60.05(0.23)0.005(4.00)0.05(>2.59)0.005(>5.88)0.05(>0.65)0.025(0.97)B80.025(0.12)—0.025(1.30)——0.0125(0.49)B90.05(0.23)0.005(4.00)—0.005(5.88)0.05(>0.65)0.025(0.97)B11—0.0025(2.00)—0.005(5.88)——B12—0.005(4.00)——0.05(>0.65)—

Ga4、Gi4最低抑菌浓度为体积比；“—”为未进行试验；“>”为MIC超过本试验浓度上限；“( )”内数值为最低抑菌浓度对应的样品鲜质量浓度。

MIC of Ga4 and Gi4 were displayed by volume ratio; “—” indicated experiment was not carried out; “>” indicated MIC was above test concentration limit; Data in “()” was the sample fresh weight concentration corresponded to the MIC.

图2 Go3提取物对B1菌株最低抑菌浓度测定Fig.2 Determination of minimum inhibitory concentration of Go3 extract against to B1 strain

3 讨论

3.1植物源抑菌剂的优势

植物组织培养中细菌污染主要通过接触污染，如外植体带菌、人员操作不当或器械消毒不严格等。控制植物组培细菌污染除了定期严格的人员、环境消毒、操作流程的规范以及选择无菌的外植体等途径外，在培养基中添加一定浓度的抗生素，如青霉素、链霉素、四环素及硫酸庆大霉素等也能获得一定的抑菌效果[11-12]。然而，抗生素残留、环境污染、部分抗生素价格昂贵、伤害组培苗等问题一直制约着植物组织培养中抗生素的添加。

与抗生素相比，植物源抑菌剂具有低毒、低残留、对组培苗伤害小及与环境相容等优势。王赵玉等[13]研究表明，适当浓度的大蒜素与代森锰锌均能降低组培试验污染率，且不会对植物产生不利影响。曾云英等[14]发现植物源与化学合成的抑菌剂在矮牵牛开放组培中均有良好作用，化学合成抑菌剂较植物源抑菌剂效果强，但对植物伤害较大。据报道，国内外有1 000余种植物被检测出有杀菌活性，国内的研究热点主要集中在连翘、板蓝根、苦参及鱼腥草等中草药植物。本研究以生姜、洋葱、大蒜和苦瓜为提取材料，4种植物材料相对于中草药具有低成本及材料易获取等优势。目前，植物源抑菌剂的应用主要集中在对植物病原真菌的防治，有关植物组培污染细菌防治方面的研究较少，本研究为植物源抑菌剂在植物组培污染细菌防治方面的应用提供了参考。

3.2 四种植物提取物的抑菌活性

据报道，生姜、洋葱、大蒜和苦瓜4种植物对多种植物病原菌及细菌具有较好的抑制效果。国淑梅等[15]研究发现，大蒜及生姜提取液对平菇生产中常见的3种芽孢杆菌属细菌均有抑制作用。杨敏等[16]测定了大蒜、洋葱和葱茎挥发物及提取液对26种主要植物病原真菌和卵菌的抑制活性，发现大蒜、洋葱和葱茎的挥发物和浸提液具有广谱抗植物病原真菌和卵菌的活性。文良娟等[17]研究表明，苦瓜70%乙醇提取物对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌的抑制作用明显。

本研究抑菌试验结果表明，大蒜乙醇超声粗提物、大蒜挥发油和生姜挥发油对污染菌株具有较好的抑制效果，生姜、洋葱、苦瓜的乙醇超声提取物较水超声提取、热水浸提法的综合抑菌效果强。洋葱粗提物对12个菌株中的9个菌株有抑制效果，抗菌谱较生姜、大蒜、苦瓜提取物广。不同菌株对不同抑菌剂的敏感程度不同，复配使用可以提高效果[18-19]。本研究结果表明，单种植物抑菌剂对不同菌株抑制作用存在差异，不同植物抑菌剂的抗菌谱存在互补作用，因此，在植物组培中采用单一抑菌剂可能达不到最佳效果，如果将其复配成混合抑菌剂，可以提升抗菌谱范围，增强抑菌效果。

3.3 提取方法对抑菌活性的影响

不同提取方法对提取物抑菌活性具有显著影响。穆可云[20]研究了大蒜水提取物、乙醇提取物及酸性水溶液提取物对蜡样芽孢杆菌的抑制效果，发现3种提取物都有抑制效果，并且抑菌效果依次增强。温度稳定性试验结果表明，高温处理会降低洋葱粗提物的抑菌能力[21-22]。本研究表明，生姜挥发油对假单胞菌属(B2)有抑制效果，而生姜水超声提取、热水浸提、乙醇超声提取粗提物对假单胞菌属(B2)均无抑制效果，这说明提取方式影响植物抑菌活性物质的溶解性或稳定性。本试验中，乙醇超声提取较热水浸提、水超声提取方法更能溶解出抑菌物质，挥发油与溶剂提取物具有不同的抑菌谱。联合不同方法综合提取抑菌物质，可以更大潜力地发掘植物抑菌物，如溶剂提取同时联合挥发物收集装置，可获得更多抑菌活性物质，其抗菌谱也更广。

与前人研究相比，本研究中抑菌剂的MIC值偏高[23-24]，可能是提取物浓缩过程破坏了部分抑菌物质，尤其是苦瓜粗提物浓缩后再溶解不完全，沉淀明显，也可能是本研究的菌株是从被污染组培植物中分离的，这些菌株可能对部分植物源抑菌物不敏感。后续研究可进一步明确植物源抑菌剂的作用机理，开发联合提取方法，采用复配抑菌剂，将扩大植物抑菌剂的抗菌谱，提升抑菌效果。

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HE J P， SUI Y J， CHEN X H， et al. Study on bacteriostasis and thermal stability ofAlliumcepaL. ethanol extract[J].ScienceandTechnologyofFoodIndustry， 2010 (12): 153-155. (in Chinese with English abstract)

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GUO J P. Study on antibacterial activity of raw onion juice[J].ChinaCondiment， 2012， 37(12): 21-23. (in Chinese with English abstract)

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ZHANG P P， LIU J F， WANG C L， et al. Study on the antimicrobial activities of the extracts fromMomordicacharantiaL.[J].NaturalProductResearchandDevelopment， 2008 (20): 721-724. (in Chinese with English abstract)

[24] 林标声， 张婷婷， 沈绍新. 蒜、姜、辣椒乙醇提取物抑菌活性的研究[J]. 龙岩学院学报， 2009， 27(5): 85-88.

LIN B S， ZHANG T T， SHEN S X. Research on antimicrobial activities of ethanol extracts from ginger， garlic and hot pepper[J].JournalofLongyanUniversity， 2009， 27(5): 85-88. (in Chinese with English abstract)

(责任编辑侯春晓)

Inhibitionoffourvegetableedibleorganextractsonbacterialcontaminationinplanttissueculture

LI Bai1， GAO Guangchun2， FANG Qi2， LI Jun1，*

(1.JiaxingAcademyofAgriculturalSciences，Jiaxing314016，China; 2.SchoolofMedicineScience，JiaxingUniversity，Jiaxing314001，China)

Plant extracts were obtained from four vegetable edible organs including ginger rhizome， onion bulb， garlic bulb and bitter gourd fruit. The extraction methods were hot water extraction， ultrasonic wave extraction with water， ultrasonic wave extraction with ethanol， volatile oil extraction. Inhibition of these extracts on bacterial contamination in the production of tissue culture were discussed. The results showed that the crude extracts from the four plants had inhibition on the bacteria while single plant extracts could not inhibit all the bacteria. Crude extracts obtained by different extraction methods had different antimicrobial effects. Ultrasonic wave extraction with ethanol had the best antibacterial effect among the three solvent extraction methods. The essential oil from garlic and ginger could significantly inhibitPseudomonas(B2) andEnterobacter(B11)， and other extracts had no significant inhibition. Minimum inhibitory concentration results showed that the MIC value of crude extract from garlic using ultrasonic wave extraction with ethanol was lower than those of other extracts， ginger and garlic essential oil had low MIC value and higher fresh weight. This research could provide references for the prevention and control of bacterial contamination in plant tissue culture.

plant extracts; plant tissue culture; bacteria; minimum inhibitory concentration

李白， 高广春， 方琪， 等. 四种蔬菜食用器官提取物对植物组培污染细菌的抑制作用[J]. 浙江农业学报， 2017， 29(11): 1854-1861.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.11.11

2017-05-19

嘉兴市科技计划项目(2016BY26005)

李白(1986—)，男，浙江温州人，硕士，农艺师，主要从事植物生物技术研究。E-mail: libaia@yeah.net

*通信作者，李军，E-mail: lijunjx1@163.com

S188

A

1004-1524(2017)11-1854-08