杯鞘石斛链格孢病菌生物学特性

梁林波，王仕玉，杨建华，*，张雨思

(1.云南省林业科学院 漾濞核桃研究院，云南 漾濞 672500； 2.云南农业大学 园林园艺学院，云南 昆明 650201)

杯鞘石斛链格孢病菌生物学特性

梁林波1，王仕玉2，杨建华1，*，张雨思1

(1.云南省林业科学院 漾濞核桃研究院，云南 漾濞 672500； 2.云南农业大学 园林园艺学院，云南 昆明 650201)

对杯鞘石斛链格孢病菌的生物学特性进行了研究，结果表明，温度、pH值、光照、碳源和氮源对其生长和产孢有一定的影响。链格孢病菌最适宜生长的温度是25 ℃，在40 ℃几乎不能生长；最适宜的pH值为5～6；25 ℃ 12 h/12 h (L/D)光暗交替培养产孢量最多；能较好地利用蔗糖、葡萄糖、乳糖和淀粉碳源，但对不同的碳源利用有差异；供试氮源中，在含硝酸铵的培养基中菌落生长直径最大，而含甘氨酸的培养基中菌落生长较差。

杯鞘石斛；链格孢菌；pH；碳源；氮源；菌落直径

兰科石斛属(DendrobiumSw.)植物是名贵的中药材，药用历史悠久，以新鲜和干燥的茎入药，具有滋阴清热、生津益胃、长肌肉、益智除惊、润肺止咳、健身延年的功效，被誉为“中华九仙草”之首[1-2]。兰科石斛属中的杯鞘石斛(DendrobiumgratiosissimumRchb .f.)又名甘节草，分布在云南南部、印度北部、缅甸、老挝和泰国[3]。链格孢菌(AlternariatenuisNees)是一种常见的真菌性病原，在自然情况下常生于植物的枯死部分(病斑、伤、死部位等)或衰弱濒死组织和种子内外，或腐生于多种有机物质上或土壤中，在基质表面形成厚薄不同的暗色霉层[4]。该病菌会对五味子[5]、红花[6]、万寿菊[7]、藿香[8]等造成危害，能诱发石斛感病。石斛发病时嫩叶呈褐色斑点，病斑逐渐扩散至整片叶子，严重时黑斑在叶片上互相连成片，最后叶片枯萎脱落。该病对石斛生产造成了较大影响，为了能有效防治该病发生，本研究对采集的杯鞘石斛感病植株进行观测，记录叶片病斑大小、形状、颜色和感病部位；并从病叶上分离鉴定出链格孢菌菌种，通过离体培养对菌种的生物学特性进行研究，为进一步防治该病原菌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试病株

从云南省红河州屏边县采回的新鲜杯鞘石斛感病植株。

1.1.2 培养基

供试基础培养基为PSA培养基：马铃薯20%+蔗糖3%+琼脂0.75%的固体培养基。

分别以葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉为碳源，分别以甘氨酸、硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、蛋白胨、酸水解酪蛋白、水解乳蛋白、脲、牛肉浸膏为氮源。

1.2 方法

1.2.1 病斑观测

对杯鞘石斛感病植株的感病部位进行观测，记录叶片上病斑大小、形状、颜色。

1.2.2 病原菌的分离、培养、鉴定和保存

杯鞘石斛感病叶片用自来水冲洗后，用75%乙醇处理20 s，0.1% HgCl2消毒8～10 min，再用无菌水冲洗3～4次，在病斑处切取0.3～0.5 cm的小块材料，接种到培养基上。25 ℃全光照条件下培养25 d后，取菌丝，用无菌水稀释，用载玻片制片。在显微镜下观测分生孢子的形态特征，用于菌源鉴定，最后进行菌源培养保存。

1.2.3 病原菌生物学特性研究

温度：在直径10 cm(下同)消毒培养皿中倒入20 mL PSA培养基，接入预先培养的直径0.7 cm小菌饼，每皿2块，分别置于20、25、30和40 ℃培养，每处理重复3次。培养过程中用十字交叉法每天测量菌落的生长情况，直至不能观测为止；培养7 d后观察分生孢子的数量，取直径为0.7 cm的菌饼，用2 mL无菌水稀释，在显微镜(10×40)下检查分生孢子数，观察10个视野取平均值。

pH: PSA培养基pH值梯度分别为4、5、6、7、8。在直径10 cm消毒培养皿中倒入20 mL PSA培养基，在PSA平板培养基上接入预先培养好的直径0.7 cm小菌饼，每皿2块，25 ℃培养，每处理重复3次，观测菌落生长情况和分生孢子数，方法同上。

光照：在PSA平板培养基上接入预先培养的直径0.7 cm的小菌饼，培养温度25 ℃，光照条件分别为：1)光照24 h·d-1；2)黑暗24 h·d-1；3)光暗交替12 h/12 h(L/D)。每处理重复3次，观测菌落生长情况和分生孢子数，方法同上。

碳源：在PSA培养基中分别加入3%的葡萄糖、蔗糖、乳糖和淀粉，配制成含不同碳源的培养基，每处理重复3次。25 ℃12 h/12 h(L/D)光暗交替培养，测量菌落生长情况和分生孢子数，方法同上。

氮源：在基础培养基中分别加入0.3%的甘氨酸、硝酸钾、硝酸铵、蛋白胨等9种不同的氮源，配制成含不同氮源的培养基，以缺氮培养基作对照，每处理重复3次。25 ℃ 12 h/12 h(L/D)光暗交替培养，测量菌落生长情况和分生孢子数，方法同上。

1.2.4 病原菌致病性测定

供试寄主为具6～7片叶的兜唇石斛、钩状石斛和竹枝石斛组培苗。移栽成功后，将待接种的植株健康叶片用70%乙醇进行表面消毒，采用针刺的方法接种，每植株接种1～3片，每处理共接种10片叶子，每叶片针刺5个点。接种后保湿栽培，待叶片发病后记录发病情况。

2 结果与分析

2.1 病害症状

观测杯鞘石斛黑斑病病斑，结果(表1)表明，病斑多分布在叶片的上半部，为中间黑色，外缘有褐色晕圈，略有凹陷的近圆形、椭圆形或小圆点病斑，病斑面积0.01～0.28 cm2。

2.2 病原鉴定

经过分离的病原菌在PSA培养基上培养，菌落初期为灰白色，近圆形，后期逐渐转为黑灰色。图1为用型号PM-10AD外置式CCD摄影套件拍摄的病原菌图像，它的菌丝分枝为淡色至褐色，具隔膜；分生孢子梗褐色，单枝，具隔膜，大小为72.8 μm × 10.9 μm；分生孢子单生，褐色，卵圆形、倒棒形，有纵横隔膜，大小为54.5 μm×25.1 μm。根据病原菌分生孢子梗、分生孢子及菌丝形态特征，认定该菌为半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、暗色孢科、链格孢菌(AlternariatenuisNees)[9]。

表1杯鞘石斛叶片病斑

Table1Symptoms on leaves ofD.gratiosissimumRchb. f.

病斑编号长宽形状颜色位置DiseasespotNo.Length/cmWidth/cmShapeColourPosition10.550.45近圆形Nearround中间黑色、外缘褐色晕圈Middleblack,outerrimbrownhalo叶上部Upperpartoftheleaf20.700.40椭圆形Ovar中间黑色、外缘褐色晕圈Middleblack,outerrimbrownhalo叶上部Upperpartoftheleaf30.600.40椭圆形Ovar中间黑色,外缘褐色晕圈,略有凹陷Mediumblack,marginbrown,withsag叶上部Upperpartoftheleaf40.100.10小圆点Dots黑褐色Black-brown叶上部Upperpartoftheleaf50.150.10小圆点Dots中间黑色,外缘褐色,有凹陷Mediumblack,marginbrown,withsag叶上部Upperpartoftheleaf60.100.10小圆点Dots红褐色,有浅色晕圈Reddish-brown,withlight-coloredhalo叶上部Upperpartoftheleaf70.350.25近圆形Nearround中间黑色、外缘褐色有凹陷,干枯Mediumblack,outermarginbrownhassag,dry叶中部Middlepartoftheleaf80.500.30椭圆形Ovar黑色、干枯Blackanddry叶中部Middlepartoftheleaf90.650.50近圆形Nearround黑色,褐色晕圈,四周发黄Black,brownhalo,yellowaround叶基部Lowerpartoftheleaf

2.3 病原菌生物学特性

2.3.1 温度对链格孢菌菌丝生长和产孢的影响

由表2可知，第1～4天，链格孢菌菌落直径处理间差异均达显著水平。经多重比较可知：20、25和30 ℃培养的菌落直径均无显著性差异；培养第2～4天，40 ℃培养的菌落直径显著小于25 ℃培养。20、25和30 ℃培养的菌落直径随培养时间的延长呈逐渐增大趋势，25 ℃培养的菌落生长最快，培养至第4天时直径最大，其次是20、30 ℃培养的菌落直径；40 ℃培养的菌落直径生长缓慢，随培养时间的延长几乎无变化。不同温度培养的分生孢子数差异极显著，20 ℃培养产孢量极显著高于其他3个温度。20～30 ℃培养均能产生分生孢子，40 ℃培养不产孢。

2.3.2 pH对链格孢菌菌丝生长和产孢的影响

由表3可知，第1～5天，链格孢菌菌落直径处理间差异达极显著水平，第6天差异达显著水平。多重比较结果表明：培养第1天，pH值7、8的培养基中菌落直径极显著小于pH值4、5、6的培养基，pH值4、5、6培养基中菌落直径差异不显著；培养第2～5天，pH值5的培养基中菌落直径极显著大于pH值6、7和8的培养基；培养至第6天时，pH值4的培养基中菌落直径显著小于pH值5、6的培养基。pH值5的培养基中菌落生长快，菌落直径最大，其次是pH值6的培养基。培养7 d，处理间分生孢子数差异达极显著水平，pH值6的培养基中分生孢子数极显著多于pH值4、5、7和8的培养基，pH值7的培养基中分生孢子数最少，pH值4和8的培养基中没有孢子产生。

图1 杯鞘石斛叶片病斑病原菌的分生孢子及分生孢子梗(400×)Fig.1 Conidia and conidiophores of pathogen on D. gratiosissimum Rchb .f. leaves (400×)

表2温度对链格孢菌菌丝生长和产孢的影响

Table2Effects of temperature on the growth and sporulation ofAlternariatenuisNees

温度Temperature/℃培养不同时间(d)菌落直径Colonydiametersatdifferenttime(d)/cm1234孢子数Numberofsporespervision200.78abAB1.00abA1.38aA1.58abAB3.70aA250.85aA1.18aA1.62aA2.40aA0.40bB300.75bAB0.92abA1.43aA1.77aAB0.30bB400.70bB0.70bA0.70bA0.70bB0bBF值Fvalue4.014*3.161*3.165*4.332*6.401**

显著性测定为LSR法。同列中数据后无相同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，同列数据后无相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

Significance was determined by the LSR method. Data marked without the same uppercase letter in each column indicated significant differences atP<0.01, Data marked without the same lowercase letter in each column indicated significant differences atP<0.05. The same as bellow.

表3pH对链格孢菌菌丝生长和产孢的影响

Table3Effects of pH on the growth and sporulation ofAlternariatenuisNees

pH培养不同时间(d)菌落直径Colonydiametersatdifferenttime(d)/cm123456孢子数Numberofsporespervision41.03aA1.35aAB1.38aA1.45abAB1.50bAB1.58bA0cB51.10aA1.43aA1.47aA1.60aA1.87aA2.37aA5.90bB61.07aA1.08bB1.10bB1.32bB1.33bBC2.35aA14.70aA70.77bB0.78cC0.92bcB0.92cC0.93cC1.73abA0.60cB80.70bB0.75cC0.85cB0.87cC1.02cC1.85abA0cBF值Fvalue17.222**18.299**15.283**26.867**13.388**2.907*16.453**

2.3.3 光照对链格孢菌菌丝生长和产孢的影响

由方差分析(表4)可知，在不同光照条件下培养不同时间，链格孢菌菌落直径处理间差异均不显著，培养7 d时分生孢子数处理间差异极显著，光暗交替培养的分生孢子数极显著多于持续光照和持续黑暗培养，持续光照培养时链格孢菌产孢量最少。

2.3.4 碳源对链格孢菌菌丝生长及产孢量的影响

由方差分析(表5)可知，第1～4天，链格孢菌菌落直径处理间差异均达极显著水平。多重比较结果表明：培养第1～4天时，以淀粉为碳源的培养基中菌落直径显著大于以葡萄糖、蔗糖和乳糖为碳源的培养基，以葡萄糖为碳源的培养基中菌落生长缓慢，菌落直径最小。不同碳源的培养基培养7 d时分生孢子数处理间差异极显著，以葡萄糖为碳源的培养基中分生孢子数极显著多于以蔗糖、乳糖和淀粉为碳源的培养基，以淀粉为碳源的培养基中无孢子产生。

表4光照对链格孢菌菌丝生长和产孢的影响

Table4Effects of light condition on the growth and sporulation ofAlternariatenuisNees

处理Treatments培养不同时间(d)菌落直径Colonydiametersatdifferenttime(d)/cm12345孢子数Numberofsporespervi-sion光照Light1.00aA1.40aA2.03aA2.85aA2.95aA11.5bB黑暗Dark0.95aA1.00aA1.18aA2.25aA2.40aA26.5bB光暗交替Lightblackalternating0.85aA1.18aA1.65aA2.57aA2.95aA64.0aAF值Fvalue1.9441.4982.2111.2100.5408.344**

表5碳源对链格孢菌菌丝生长和产孢的影响

Table5Effects of carbon sources on the growth and sporulation ofAlternariatenuisNees

碳源Carbonsources培养时间(d)菌落直径Colonydiametersatdifferenttime(d)/cm1234孢子数Numberofsporespervision葡萄糖Glucose0.70bB0.70bB0.70bB0.80bB2.3aA蔗糖Sucrose0.70bB0.70bB0.80bB0.85bB0.4bB乳糖Lactose0.70bB0.78bB0.82bB0.90bB0.3bB淀粉Starch1.02aA1.45aA2.37aA3.05aA0bBF值Fvalue27.769**28.107**70.804**40.664**27.041**

2.3.5 氮源对链格孢菌菌丝生长及产孢量的影响

由表6可知，第1～4天，链格孢菌菌落直径处理间差异均达极显著水平。多重比较结果表明：培养第1天时，以蛋白胨和水解乳蛋白为氮源的培养基中菌落直径较大，分别达0.93和0.88 cm；培养第2天时，以硝酸钾、硝酸铵为氮源的培养基中菌落直径较大；培养第3天，以硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵为氮源的培养基中菌落直径较大；培养至第4天时，以硝酸铵为氮源的培养基中菌落直径达3.63 cm，极显著大于其他8种氮源培养基和无氮培养基，以牛肉浸膏、甘氨酸为氮源的培养基和无氮培养基中菌落直径较小。综上，以硝酸铵为氮源的培养基中菌落生长快，菌落直径最大；以甘氨酸为氮源的培养基中菌落直径最小。不同氮源的培养基培养7 d时分生孢子数处理间差异达极显著水平，以水解乳蛋白为氮源的培养基中分生孢子数最多。无氮培养基和以水解乳蛋白、牛肉浸膏为氮源的培养基均能产生分生孢子，以牛肉浸膏为氮源的培养基中分生孢子数最少，以甘氨酸、硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、蛋白胨、酸水解酪蛋白和脲为氮源的培养基中均无分生孢子产生。

2.4致病性测定

接种链格孢菌1 d后，兜唇石斛和钩状石斛开始感病，竹枝石斛没感病。接种4 d后兜唇石斛的发病率为100%，7 d后钩状石斛的发病率为100%，竹枝石斛的发病率为0。感病叶片的病斑呈近圆形、黑褐色、外缘褐色，症状表现与采集的杯鞘石斛叶片黑斑病病斑相似。

3 结论与讨论

本研究表明，杯鞘石斛链格孢菌菌丝生长及产孢所需的适宜环境温度为20～30 ℃，最适宜菌丝生长和产孢的环境温度分别为25、20 ℃；光照条件对杯鞘石斛链格孢菌菌丝生长影响不大，但在光暗交替12 h/12 h(L/D)下产孢量最大。赤水金钗石斛链格孢菌(Alternariatenuissima)最适宜菌丝生长和产孢的温度为25 ℃，光照条件对菌丝生长和产孢无明显的影响[10]；五味子链格孢菌(Alternariatenuissima)最适菌丝生长和产孢的环境温度分别为30、25 ℃，持续黑暗有利于菌丝生长和产生分生孢子[5]。杯鞘石斛链格孢菌在pH值5～8时菌丝生长较好，最适pH值为5，分生孢子在pH值5～6时产孢量最多；杯鞘石斛链格孢菌在以淀粉为碳源的培养基上菌丝生长较好，但无孢子产生，在以葡萄糖为碳源的培养基上产孢量最大；在以硝酸铵为氮源的培养基上菌丝生长较好，以水解乳蛋白和牛肉精膏为氮源的培养基有利于其产生孢子。五味子链格孢菌菌丝生长最适pH值为8，最适产孢pH值为6～7，菌丝生长和产孢的最适碳源分别是麦芽糖、果糖，菌丝生长和产孢的最适氮源是蛋白胨，甘氨酸也有利于孢子的产生[5]。说明同种链格孢菌在不同植物上菌丝生长和产孢最适温度、光照条件、pH、碳源和氮源有所差异，杯鞘石斛链格孢菌对酸性环境适应能力强，这可能与植株的生长环境有关。

表6氮源对链格孢菌菌丝生长和产孢的影响

Table6Effects of nitrogen sources on the growth and sporulation ofAlternariatenuisNees

氮源Nitrogensources培养不同时间(d)菌落直径Colonydiametersatdifferenttime(d)/cm1234孢子数Numberofsporespervision甘氨酸Glycine0.70dC0.75cdB0.75cB0.78dC0cB硝酸钾Potassiamnitrate0.78bcdBC1.28aA1.38abAB2.03bB0cB硝酸铵Ammoniumnitrate0.77cdBC1.20abA1.85aA3.63aA0cB硫酸铵Ammoniumsulfate0.85abcABC1.00abcdAB1.42abAB1.33bcdBC0cB蛋白胨Peptone0.93aA1.03abcAB1.18bcAB1.45bcdBC0cB酸水解酪蛋白Acidhydrolyzedcasein0.75cdBC0.95bcdAB1.07bcB1.40bcdBC0cB水解乳蛋白Lactalbuminhydrolysate0.88abAB0.92bcdAB1.03bcB1.67bcBC0.6aA脲Ureas0.70dC0.70dB0.85bcB1.03cdC0cB牛肉浸膏Beefextract0.70dC0.72dB0.77cB0.87dC0.3bcAB无氮Nonitrogen0.70dC0.70dB0.80cB0.85dC0.4abABF值Fvalue5.565**4.683**3.998**14.43**4.955**

杯鞘石斛链格孢菌在人工接种条件下能浸染兜唇石斛和钩状石斛，但不浸染竹枝石斛，兜唇石斛的发病最快，钩状石斛其次，表明链格孢病菌在不同石斛种类上发病情况不一致，可能是不同石斛种类对链格孢菌的抗病能力不同所致。可以根据种植的环境温度、土壤酸碱度、光照等特征掌握石斛黑斑病发生的规律，为今后石斛种植中病害预测、预报及研究提供参考。

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(责任编辑侯春晓)

BiologicalcharacteristicsofAlternariatenuisNeesonDendrobiumgratiosissimumRchb.f.

LIANG Linbo1， WANG Shiyu2， YANG Jianhua1，*， ZHANG Yusi1

(1.YangbiHickoryResearchInstitute，YunnanAcademyofForestry，Yangbi672500，China; 2.FicultyofLandscapeandHorticulture，YunnanAgricultureUniversity，Kunming650201，China)

Biological characteristics ofAlternariatenuisNees onDendrobiumgratiosissimumRchb. f. were studied. The results showed that temperature， pH， light， carbon source and nitrogen source affected the growth and sporulation of the fungus. The optimal growth temperature was 25 ℃， whileAlternariatenuisNees almost could not grow at 40 ℃. The optimal pH was 5.0-6.0. The optimal light conditon for sporulation was 12 h lighting and 12 h dark circle in a day at 25 ℃; Sucrose， glucose， lactose and starch could be used as carbon sources at different level in PSA medium. So did the nitrogen sources. Colony diameter was the biggest when NH4NO3was used as nitrogen source， while smallest when glycine was used as nitrogen source.

DendrobiumgratiosissimumRchb. f.;AlternariatenuisNees; pH; carbon source; nitrogen source; colony diameter

梁林波， 王仕玉， 杨建华， 等. 杯鞘石斛链格孢病菌生物学特性[J]. 浙江农业学报， 2017， 29(11): 1862-1867.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.11.12

2017-05-12

梁林波(1982—)，女，云南宾川人，学士，研究实习员，主要从事林下种植及林产品加工研究工作。E-mail: 1297624480@qq.com

*通信作者，杨建华，E-mail: 414078502@qq.com

S432.4+4

A

1004-1524(2017)11-1862-06