不同浓度SDG对奶牛乳腺上皮细胞增殖及泌乳能力的影响

古丽娜·巴克，迪丽胡玛·吐尔逊，阿拉努尔·库尔班，马尔哈巴·帕尔哈提

（新疆农业大学动物科学学院，新疆乌鲁木齐830052）

不同浓度SDG对奶牛乳腺上皮细胞增殖及泌乳能力的影响

古丽娜·巴克，迪丽胡玛·吐尔逊，阿拉努尔·库尔班，马尔哈巴·帕尔哈提

（新疆农业大学动物科学学院，新疆乌鲁木齐830052）

【目的】用植物雌激素亚麻籽木脂素（SDG）处理奶牛原代乳腺上皮细胞，观察SDG对奶牛乳腺上皮细胞增殖及泌乳能力的影响。【方法】将用无血清的DMEM/F12培养基培养的对数生长期奶牛原代乳腺上皮细胞分为对照组和试验组，即0 μg/mL的SDG组和添加1、10、50、100、150、200 μg/mL SDG的试验组，分别处理0 h、12 h、24 h、48 h、72 h后收集各组细胞培养液，检测奶牛乳腺上皮细胞增殖能力及活力以及奶牛乳腺上皮细胞β-酪蛋白分泌情况。【结果】不同浓度SDG对奶牛乳腺上皮细胞均有提高增殖能力及活力的作用，且添加不同剂量的SDG均具有促进奶牛乳腺上皮细胞分泌β-酪蛋白作用，且呈明显的剂量依赖性。【结论】浓度为150 μg/mL的SDG培养奶牛原代乳腺上皮细胞48 h，奶牛乳腺上皮细胞的增殖能力与活力以及分泌β-酪蛋白的效果最好。

SDG；乳腺上皮细胞；细胞增殖；细胞活力；泌乳性能

植物雌激素（Phytoestrogen，PE）是一类来源于植物的具有类雌激素活性的非甾族杂环多酚类化合物。因植物雌激素的杂环多酚母核与内源雌激素的甾体结构相似，可与雌激素受体（Estrogen Receptor，ER）结合，在哺乳动物体内产生调节作用[1]。目前研究较深入的植物雌激素主要有异黄酮类（Isoflavones）、木脂素类（Lignans）、二苯乙烯类（Stibenes）、香豆雌酚类（Coumestans）和真菌类（Mycoestrogen）等[2]。研究报道，亚麻籽中富含木脂素[3,4]，而亚麻籽木脂素（SDG）也是一种具有雌激素样活性的物质[1,2]，能促进大鼠乳腺发育并提高产奶量[5,6]。近年来，利用激素调控奶牛乳腺细胞的增殖已成为科研人员研究的热点问题。然而，目前SDG在乳腺细胞方面的研究主要集中在动物模型大小白鼠上，而截止目前为止，SDG在奶牛乳腺细胞方面的研究几乎空白。因此，本研究以体外培养泌乳期奶牛乳腺上皮细胞为研究对象，探讨SDG对奶牛乳腺上皮细胞的增殖和分化效果，为今后SDG在奶牛乳腺上皮细胞中的研究奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

奶牛原代乳腺上皮细胞购于上海生工生物工程有限公司。

DMEM/F12培养基购于美国Invitrogen公司；优质胎牛血清购于Gibco公司产品；β-酪蛋白标准品和乳糖标准品购于Sigma公司；其他常规试验药品及试剂为国产。

SDG（含量40%）购自陕西锦泰生物技术有限责任公司。

1.2 试验仪器

P1201高效液相色谱仪（中国辽宁）；QP-80型CO2培养箱（国产）；全自动酶联免疫分析仪（美国Thermo electron公司）；SZ-93自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；DFC280倒置相差显微镜（德国LEICA）；Model DT CASY细胞计数仪（CASY，德国）。

1.3 乳腺上皮细胞的培养

将奶牛原代乳腺上皮细胞稀释至1×105/mL并接种于培养瓶，加入DMEM/F12培养基，在CO2培养箱中培养48 h，之后换1次培养液继续培养，当培养瓶中细胞生长至70%～80%即可开展后续试验。

1.4 试验设计

将1.3中培养好的奶牛乳腺上皮细胞以1×105/mL的密度接种于6孔板中，细胞贴壁后用无血清的DMEM/F12培养基培养1 d，之后将每3孔设为一组进行试验。试验分为对照组和试验组，即对照组添加0 μg/mL SDG，试验组分别添加1、10、50、100、150、200 μg/mL SDG组。分别处理0 h、12 h、24 h、48 h、72 h后收集各组细胞培养液进行试验。

1.5 MTT法检测细胞增殖

试验方法参考[7-9]。

（1）将乳腺细胞悬液200 μL以1×105/mL接种于96孔板中，37℃、5%CO2培养箱中培养48 h，去除96孔板加入20 μL/孔MTT液，继续培养4 h；

（2）去除96孔板，并轻轻吸出孔内培养液，加入150 μL/孔DMSO液，在室温条件下，将96孔板置于震荡器上震荡10 min至蓝紫色结晶物充分溶解；

（3）全自动酶联免疫分析仪设定波长为490 nm用于检测各孔OD值。

1.6 CASY细胞计数仪检测细胞增殖能力与活力

重新在6孔板中接种对数生长期的1×105/mL的密度乳腺上皮细胞，待细胞贴壁后用无血清的DMEM/F12培养基培养24 h，再进行分组试验。试验分组情况同1.4。分别收取处理24 h、48 h、72 h后的各组细胞样品，用Model DT CASY细胞计数仪检测细胞增殖能力与活力。

1.7 乳蛋白的测定

乳蛋白的测定方法参考[10]。

β-酪蛋白的含量采用高效液相色谱测定（HPLC）。HPLC的检测条件：Φ7.8 mm×300 mm的TSK凝胶柱、室温、280 nm波长；经过0.22 μm无机滤膜过滤超声脱气的超纯水、0.60 mL/min的流速、10 μL的进样体积作为流动相。用0.22 μm无机滤膜过滤超声脱气的超纯水溶解β-酪蛋白标准品，分别按照1、5、10、15、20 mg/mL的浓度进样，以β-酪蛋白浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立β-酪蛋白标准曲线。分别收集已处理48 h的乳腺细胞培养液，液相色谱检测β-酪蛋白含量。设3个重复。

1.8 数据处理与统计分析

试验数据采用SPSS19.0进行数据处理统计分析，进行单因素方差分析。数据均以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 MTT法测定不同浓度SDG培养液处理奶牛乳腺细胞不同时间点对细胞增殖的影响

表1、图1显示：与对照组（0 μg/mL）相比，1 μg/mL的SDG无血清DMEM/F12培养基乳腺细胞，不同时间段增值效果差异均不显著（P＞0.01）；10 μg/mL的SDG血清DMEM/F12培养基乳腺细胞12、24、72 h，与对照组比较各组乳腺细胞的增值效果差异均极显著（P＜0.01），而48 h各组乳腺细胞的增值效果差异显著（P＜0.05）；50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL的SDG无血清DMEM/F12培养基乳腺细胞，与对照组比较各组乳腺细胞的增值差异均极显著（P＜0.01）；且48 h 150 μg/mL的SDG组乳腺细胞生长趋势最好。

图1 不同浓度SDG培养液处理乳腺细胞不同时间点对细胞增殖的影响

2.2 CASY细胞计数仪检测不同浓度SDG对奶牛乳腺上皮细胞增殖能力及活力的影响

由表2得知，随着添加的SDG浓度的增高，细胞的增殖能力与活力均得到明显的提高，尤其是当培养液中添加50、100、150、200 μg/mL浓度SDG时，细胞的增殖能力与活力均显著提高（P＜0.05），且有一定的剂量依赖性，除去SDG浓度为150、200 μg/mL之间外，其他各组间均差异显著（P＜0.05）；且从结果也可以看出，培养液中SDG的添加浓度为150 μg/mL时，细胞的增殖能力与活力为最好。

表2 不同浓度SDG培养液处理乳腺细胞48 h对细胞增殖能力及活力的影响（OD490nm，n=3）

2.3 SDG对奶牛乳腺上皮细胞β-酪蛋白分泌情况的影响

2.3.1 β-酪蛋白标准曲线的建立

将β-酪蛋白浓度设定为横坐标，峰面积设定为纵坐标，建立标准曲线得回归方程。在1～20 μg/mL的范围内重复进样，R2均在0.9996。

图2 β-酪蛋白标准曲线

2.3.2 不同浓度SDG对奶牛乳腺上皮细胞β-酪蛋白分泌的影响

由表3可知，当细胞培养液中分别添加50、100、150、200 μg/mL浓度SDG时，细胞分泌β-酪蛋白的量较对照组分别显著提高了3.50%、6.74%、9.16%、8.36%（P＜0.05），且各组间差异显著（P＜0.05）；而添加浓度为1、10 μg/mL时，细胞分泌的β-酪蛋白与对照组比较无明显差异（P＞0.05）；且当细胞培养液中SDG的添加量为150 μg/mL时，乳腺上皮细胞分泌的β-酪蛋白的效果最好。

表3 不同浓度SDG对乳腺上皮细胞分泌β-酪蛋白的影响（n=3）

3 讨论

3.1 不同浓度SDG对奶牛乳腺细胞增殖与活力的影响

植物雌激素的结构与内源雌激素的甾体结构相似，可与雌激素受体结合，在哺乳动物体内产生调节作用[1]，亚麻籽木脂素是植物雌激素的一种，能与乳腺细胞ER结合，通过调节下丘脑-垂体-生长激素轴或催乳素轴来分泌GH和PRL，从而调控乳腺发育[11-15]。穆莹等[10]研究报道，乳腺上皮细胞中加入不同浓度植物雌激素大豆黄酮培养24 h可一定浓度范围内促进奶牛乳腺上皮细胞的增殖；欧阳五庆等[16]试验报道，植物雌激素大豆黄酮能促进大鼠乳腺上皮细胞的增殖；而刘春龙[17]发现，植物雌激素大豆黄酮能加速奶牛乳腺上皮细胞的增殖。在本试验结果发现，当培养液中添加50、100、150、200 μg/mL浓度植物雌激素亚麻籽木脂素（SDG）时，奶牛乳腺上皮细胞的增殖能力与活力均显著高于0 μg/mL的对照组（P＜0.05）。可能的机制是：SDG通过作用于奶牛乳腺上皮细胞上的ER，并与之结合，产生一定的雌激素效应，作用于乳腺上皮细胞进而促进乳腺上皮细胞的增值与分化。

3.2 不同浓度SDG对奶牛乳腺上皮细胞β-酪蛋白分泌的影响

β-酪蛋白是检测奶牛乳品质的重要指标之一，牛乳中β-酪蛋白含量高牛乳质量好，反之牛乳质量差。β-酪蛋白的分泌受多重因素的调控，而内分泌激素是重要的调控因子。Akers[18]研究发现在乳腺上皮细胞中添加17β-雌二醇可以显著增加催乳素诱导的α-乳白蛋白的表达。本实验研究发现，当细胞培养液中分别添加50、100、150、200 μg/mL浓度SDG时，细胞分泌β-酪蛋白的量显著提高，表明一定浓度的SDG具有增强奶牛乳腺上皮细胞合成β-酪蛋白的能力。这一结果也为今后SDG的功能研究奠定了一定的基础。

4 结论

MTT法测定不同浓度SDG处理奶牛乳腺上皮细胞时，SDG具有促进细胞增殖作用，且最佳作用时间为48 h和最佳浓度为150 μg/mL；

用CASY细胞计数仪检测不同浓度SDG对奶牛乳腺上皮细胞增殖能力及活力，发现SDG的添加浓度为150 μg/mL时，细胞的增殖能力与活力为最好；

当细胞培养液中分别添加50、100、150、200 μg/mL浓度SDG时，细胞分泌β-酪蛋白的量显著提高，且呈明显的剂量依赖性，且SDG的添加量为150 μg/mL时，乳腺上皮细胞分泌的β-酪蛋白的效果最好。

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Effects of Different Concentrations of SDG on the Mammary Gland Epithelial Cells Proliferation and Lactating Capacity in Cow

GULIA·Bake，DILIHUMA·Tursun，AILANUER·Kurba，MAIERHABA·Parhat
（College of Animal Science，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China）

s：The effects of different concentrations of flaxseed lignans（SDG）on the mammary gland epithelial cells proliferation and lactating capacity was investigated.DMEM/F12free serum culture medium added 1，10，50，100，150，200 μg/mL SDG were using primary mammary epithelial cells culture.After culture 0 h，12 h，24 h，48 h and 72 h，detection of proliferation and beta casein secretion.The result show that treatment with all concentrations of SDG can promote the proliferation and beta casein secretion of bovine mammary epithelial cells.For primary mammary epithelial cells，using the culture medium added 150 μg/mL SDG and cultured after 48 h culture is potent for cell proliferation and beta casein secretion.

SDG；mammary gland epithelial cells；cell proliferation;cell viability；lactation capacity

S823.9+1

A

1003-6377（2017）06-0005-06

新疆少数民族科技人才特殊培养计划项目“亚麻籽木脂素对奶牛乳腺发育影响极其作用机理研究”（201523127）；国家级大学生创新创业训练计划项目“亚麻籽木脂素的雌激素样活性研究”（220141063）

古丽娜·巴克（1976-），女（维吾尔族）,新疆阿克苏人，讲师，博士。E-mail：gulnar@xjau.edu.cn

2017-09-16，

2017-09-28

10.16863/j.cnki.1003-6377.2017.06.002