山羊地方性鼻内肿瘤病毒和支原体混合感染山羊的诊断

林裕胜 ， 江锦秀 ， 游 伟 ， 胡奇林

(福建省农业科学院畜牧兽医研究所 ， 福建 福州 350013)

山羊地方性鼻内肿瘤病毒和支原体混合感染山羊的诊断

林裕胜 ， 江锦秀 ， 游 伟 ， 胡奇林

(福建省农业科学院畜牧兽医研究所 ， 福建 福州 350013)

2016年10月福州市一山羊养殖户的山羊发病，经临床症状、剖检病变及实验室检验，确诊为羊地方性鼻内肿瘤病毒(Enzooticnasaltumorvirus, ENTV)、绵羊肺炎支原体(Mycoplasmaovipneumoniae, Mo)和丝状支原体山羊亚种(Mycoplasmamycoidessubsp.capri,Mmc)混合感染引起的山羊呼吸道疾病，报告如下。

1 发病情况

福州市北峰一农户共饲养山羊150只，以山地放牧为主。2016年4月3日发现2只1岁左右山羊发病，表现为流鼻涕、咳嗽和呼吸困难，病羊被毛粗乱，采食量减少、消瘦，发病后期，羊鼻甲骨软化，用手按即可凹陷。到9月11日，已有8只山羊发病，其中2～6 月龄羊发病6只，成年羊发病2只，其中1只面部肿胀。这次疫情共发病8只，发病率为5.3%，未出现死亡。该羊场发病早期已用青霉素、恩诺沙星、林可霉素、替米考星、氧氟沙星、卡拉霉素、头孢菌素等抗生素进行治疗，无明显疗效，2～3 d后又复发。

2 剖检病变

剖检2只病羊，发现肺脏与肋骨粘连，胸腔内有少量积液，胸膜增厚，肺部一侧呈“肉变”，肺小叶间质明显增宽，气管和支气管有大量黏液分泌。心包内有清亮积液，心包膜增厚；锯开鼻窦，可见左侧鼻道内有灰白色息肉状物，与鼻黏膜相连，表面光滑，呈透明状。质地柔软、易碎(见中插彩版图1、图2)。

3 实验室检验

3.1 主要试剂 反转录试剂盒，购自Promega公司；PremixTaqTM聚合酶、DL-2 000 Marker，购自宝生物工程(大连)有限公司；动物组织/细菌DNA提取试剂盒，购自上海生工生物工程技术服务有限公司；病毒RNA提取试剂盒，购自北京全式金生物技术有限公司。

3.2 引物设计 针对Mo P80基因、Mmc MLC_1760基因和山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae, Mccp)arcA基因序列，利用Primer 6.0软件分别针对这3种病原设计特异性引物；ENTV、多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida, Pm)和溶血性曼氏杆菌(Mannheimiahaemolytica, Mh)则直接采用参考文献[1-2]所设计的特异性引物，见表1；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 特异性引物

3.3 病料的处理 在生物安全柜内对采集的鼻内容物和肺脏经剪碎、研磨，加0.01 mol/L pH值7.2 PBS(缓冲液)制成10%匀浆，-70 ℃保存备用。

3.4 病毒、支原体和细菌核酸的提取

3.4.1 病毒RNA提取：取200 μL病料研磨上清液加到1.5 mL离心管中，利用北京全式金生物技术有限公司病毒RNA提取试剂盒提取ENTV基因组RNA， -20 ℃保存备用。

3.4.2 支原体和细菌DNA提取：取1 mL病料研磨上清液加入1.5 mL离心管中，10 000 r/min离心3 min，弃上清收集菌体，利用生工组织/细菌DNA提取试剂盒提取支原体和细菌DNA，-20 ℃保存备用。

3.5 RT-PCR及PCR检测 按Progema公司RT-PCR试剂盒说明书进行，采用20 μL的反转录反应体系。

检测ENTV PCR反应体系参考文献[1]，以经测序验证的ENTV RNA作阳性对照，以Pm DNA作阴性对照。

检测Mo、Mmc、Mccp多重PCR反应体系：PremixTaq10 μL，Mo上下游引物各1.3 μL，Mmc上下游引物各0.7 μL，Mccp上下游引物各1.0 μL，模板3 μL，无菌去离子水4 μL，混匀，进行短暂快速离心后进行扩增，反应条件为： 94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s、59 ℃ 15 s、72 ℃ 15 s，37个循环；72 ℃7 min，以Mo、Mmc和Mccp混合DNA作阳性对照，以Pm DNA作阴性对照。

3.6 检测结果 用PCR对2只病羊病料进行ENTV、Mo、Mmc、Mccp检测的结果显示：2份样品只检测到Mo、Mmc和ENTV的特异性条带，大小分别约为700 bp、300 bp和800 bp，Pm、Mh和Mccp均为阴性。结果见图3、4。

图3 Mo、Mmc、Mccp PCR检测结果

图4 ENTV PCR检测结果

4 诊断结果

结合流行病学、临床症状、剖检病变及实验室检验结果，确定该山羊养殖场山羊本次发病是由于ENTV、Mo和Mmc混合感染所致。

5 讨论

山羊地方性鼻内肿瘤是由ENTV引起的一种慢性、进行性、接触性传染病，其临床特征表现为呼吸困难，鼻漏，食欲减退，鼻内单侧或两侧增生；该病的发病率为0.5%～15%[3]，致死率为100%。Mo可引起羊支原体性肺炎，其临床症状表现为高热、咳嗽、喘气、渐进性消瘦、肺和胸膜发生浆液性和纤维素性炎症, 临床上呈急性或慢性经过, 病死率一般为30%～50%, 有的高达80%～100%[4-5]。Mmc是羊支原体性肺炎的病原之一，此外还可引起乳房炎、角膜结膜炎和败血病等[6]。近年来国内多省市均有羊病混合感染的报道[6-8]，尚未见ENTV、Mo和Mmc混合感染的报道。

在本次病例中，我们对病料进行了PCR检测，未检测到Mccp、Pm和Mh，只检测到了ENTV、Mo和Mmc，同时结合该病例临床上主要表现为流鼻涕、咳嗽和呼吸困难，剖检病变主要是胸腔积液，胸膜增厚，肺部 “肉变”，左侧鼻道内有灰白色息肉状物，与鼻黏膜相连等特点，确认该病例是由ENTV、Mo和Mmc混合感染所致。关于支原体和细菌混合感染引起山羊呼吸道疾病的案例李璞君等已有报道[7]，但关于ENTV和支原体混合感染的病例尚未见报道，本病例表明，引起山羊呼吸道疾病的病原体已经不单是支原体或者细菌的单一感染或者混合感染，已出现病毒和支原体混合感染的现象，使羊的疫病更加复杂化。

呼吸道疾病是一类制约当前山羊养殖业的重要疫病，给山羊养殖业造成重大经济损失，当前能够引起山羊呼吸道疾病的病原主要包括Mmc、Mccp、山羊支原体山羊亚种等丝状支原体簇成员、Mh、Pm、Mo和ENTV[6 ]。本研究室近3年来对福建省送检样品的检测结果发现，福建省当前引起山羊呼吸道疾病的支原体主要是Mo和Mmc，病毒主要是ENTV。推测可能与当前主要接种山羊传染性胸膜肺炎疫苗，对Mo和Mmc等支原体缺乏有效保护有关。ENT在世界多个国家流行，导致严重的经济损失。近年来，我国湖南、内蒙古、四川等地均有该病发生的报道。ENT具有接触传染性，病程长，临床症状主要表现为呼吸困难，鼻漏，出现鼻内单侧或双侧性增生物，这与本研究病例相一致[1]。ENT是当前世界养羊业生产中的一个难题，国内外至今未分离到ENTV,同时，ENTV免疫应答的缺陷限制了该病疫苗的研究，国内外还没有ENTV的疫苗。因此，养殖户在引种时加强监控，做好检验检疫和隔离等生物安全工作是预防该病的主要措施。对于该病的治疗，有人通过外科手术摘除增生物，但这种方法费时费力，不适合于基层推广应用。

综上所述，ENTV、Mo和Mmc可混合感染山羊引起严重的呼吸道疾病，对山羊养殖业形成严重威胁。因此，在山羊养殖过程中，需要加强对羊支原体性肺炎尤其是 ENT的防控，对ENT，目前国内外最有效的措施是净化，通过扑杀病羊及带毒羊的方法来控制该病。所以需要加强羊群的防疫工作，提高山羊的饲养管理水平，避免天气变化等因素造成的应激导致免疫功能降低从而感染ENTV。本文首次报道了福建省山羊混合感染ENTV、Mmc和Mo的临床症状和剖检病变等，为今后进行羊病的有效防治和开展流行病学调查等提供了理论依据。

[1] 余远迪,韦雷飞,黄秀君,等.4例山羊鼻内肿瘤的诊断[J].动物医学进展,2014,35(4):129-131.

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[3] 刘菲,冯迎春,颜其贵,等.四川一起山羊地方性鼻内肿瘤疫情的诊断[J].畜牧与兽医,2011,43(06):83-86.

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[5] Corona L, Cillara G, Tola S. Proteomic approach for identification of immunogenic proteins of Mycoplasma mycoides subsp. capri[J]. Vet Mic,2013, 167(3-4):434-439.

[6] 颜新敏,储岳峰,吴国华,等. 山羊痘、羊口疮及山羊传染性胸膜肺炎混合感染的检测与分析[J]. 中国兽医学报,2011,31(06):809-813.

[7] 李璞君,吴禹熹,王娟,等.一例绵羊肺炎支原体和溶血性曼氏杆菌混合感染山羊的诊断[J]. 畜牧与兽医,2016,05:126-128.

[8] 刘兵,刘保群,贺金城. 山羊痘和山羊传染性胸膜肺炎混合感染的诊治[J]. 中国畜牧兽医文摘,2012,28(09):147.

S855.1

B

0529-6005(2017)10-0059-02

2017-02-07

国家重点研发计划项目(2016YFD0500906)；公益类科研院所专项(2016R1022-10)；福建省科技创新平台建设项目(2014N2003-5)；福建省农业科学院科技创新团队PI项目(2016PI-7)；福建省农业科学院畜牧兽医研究所基金(MYQJ2015-3)

林裕胜(1988-)，男，研究实习员，硕士，主要从事动物传染病研究，E-mail：369807285@qq.com

胡奇林，E-mail：hql562713@163.com