广东地区2016-2017年规模化猪场腹泻病原调查分析

周 玲 ， 陈桂华 ， 伍子娴 ， 麦凯杰 ， 李 迪 ， 王胜阳 ， 马静云 ， 张祥斌

(华南农业大学动物科学学院 ， 广东 广州 510642)

广东地区2016-2017年规模化猪场腹泻病原调查分析

周 玲 ， 陈桂华 ， 伍子娴 ， 麦凯杰 ， 李 迪 ， 王胜阳 ， 马静云 ， 张祥斌

(华南农业大学动物科学学院 ， 广东 广州 510642)

为了解广东地区导致猪群腹泻病原的流行状况，对广东省部分地区的猪场进行猪群腹泻的流行病学调查，共采集腹泻样品273份，采用PCR和RT-PCR的方法检测能够造成猪群腹泻的病原，包括猪流行性腹泻病毒(PEDV)，猪轮状病毒(PoRV)，猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)，以及近年开始流行的猪德尔塔冠状病毒(PorcineDeltacoronavirus, PDCoV)，猪库布病毒(PorcineKobuvirus,PKoV)，猪博卡病毒(PorcineBocavirus，PBoV)，猪萨佩罗病毒(PorcineSapelovirus,PSV)。检测结果显示，PEDV仍然是导致猪群腹泻的主要病原，而TGEV没有检测到。尤为突出的是PKV仅次于PEDV的高阳性率，因此其在猪群腹泻中的作用值得进一步探索。

广东省 ； 猪群腹泻 ； 腹泻病原调查 ； PCR

自2010年以来，我国仔猪出现大范围厌食、呕吐、腹泻严重等临床症状，传播迅速，且发病仔猪死亡率高，对我国的养猪行业造成了重大损失。经研究表明，引起猪病毒性腹泻的病原较为常见的有猪流行性腹泻病毒(PEDV)，猪轮状病毒(PorcineRotavirus，PoRV)，猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)。近年有报道指出,猪德尔塔冠状病毒(PorcineDeltacoronavirus, PDCoV)，猪库布病毒(PorcineKobuvirus,PKoV)，猪博卡病毒(PorcineBocavirus，PBoV)，猪萨佩罗病毒(PorcineSapelovirus,PSV)在一定程度上可以导致猪的腹泻、呕吐症状[1]。临床样品检测结果表明，以上几种腹泻病原常常是以混合感染的形式呈现，而且对各阶段猪群都易感，特别对哺乳仔猪危害最大，引起仔猪呕吐、水样腹泻，致死率高[1]。本次研究主要是通过采集得到广东省部分地区规模化猪场的腹泻样品，对腹泻病原在当前腹泻猪群中的感染情况进行流行病学调查，以期为广东地区养猪业建立有效的综合防控措施提供参考，降低病毒性腹泻给养猪业带来的经济损失。

1 材料与方法

1.1 样品 分别采集2016年1月至2017年4月期间，在广东省不同地区43个规模化猪场中具有腹泻、呕吐、脱水、死亡等症状的发病猪群的粪便或肠道内容物，共273份。

1.2 主要试验材料 核酸提取试剂盒(Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit 250-prep)，购自Axygen公司；PrimeScript®One Step RT-PCR Kit Ver. 2(Catalog No. RR057A)、DL-2 000TMDNA Marker(Catalog No. 3427Q),购自广州瑞真生物技术有限公司(TaKaRa公司产品);核酸染料EB替代物Goldview，购自广州美津生物技术有限公司。

1.3 引物设计与合成 用于检测的引物分别参照GenBank上的相关序列，利用Primer 6.0引物设计软件，根据序列保守区域设计了PEDV、RV、PDCoV、TGEV、PKoV、PBoV、PSV的特异性引物，引物信息如表1，引物送由华大基因科技服务有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 病毒核酸的提取 将肠道内容物或粪便与生理盐水以1∶3的比列稀释，充分震荡后8 000 r/min离心10 min。取上清按爱思进核酸提取试剂盒说明书进行病毒核酸的抽提，产物于-80 ℃保存待用。

1.5 RT-PCR检测 以提取的样品核酸为模板进行RT-PCR扩增。反应体系：2× 1 Step Buffer 10 uL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1 μL，模板 2 μL，用RNase Free dH2O 补足20 μL。PCR扩增程序：50 ℃ 30 min; 95 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 32个循环；72 ℃ 10 min; 4℃ 保存。PCR扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳分析。

2 检测结果与分析

2.1 临床病料检测结果 应用PCR和RT-PCR方法对2016年1月-2017年4月采集的临床病料进行腹泻病原检测，共检测临床病料273份，发现其中PEDV阳性病料182份，总阳性率为66.7%；PoRV阳性病料64份，总阳性率23.4%；PDCoV阳性病料47份，总阳性率17.2%；273份临床腹泻病料并未检测到TGEV阳性；PKV阳性病料155份，总阳性率56.8%；PBoV阳性病料81份，总阳性率29.7%；PSV阳性病料76份，总阳性率27.8%。病原检测结果见表2。

表2 腹泻病原检测结果

2.2 病料中腹泻病原感染情况分析 对273份临床腹泻病料进行检测，结果显示,PEDV、PoRV、PDCoV、TGEV、PKoV、PBoV、PSV只有少数单独感染，分别是PEDV单独感染34份，RV单独感染4份，PDCoV单独感染4份，PKV单独感染11份，PBoV单独感染2份，PSV单独感染3份，如表3。其中PEDV与其他腹泻病原混合感染占PEDV阳性病料的81.3%，与PKV混合感染的情况最多，为94份，占PEDV与其他病原混合感染情况的66.2%。

表3 腹泻病原单独感染情况

2.3 不同时间腹泻病原检测结果分析 首先对所检测的273份样品进行时间的划分，统计出以上几种可以导致猪群腹泻的病原在腹泻猪群中不同时间的阳性检出率，统计结果见中插彩版图1。春季共检测腹泻样品93份，PEDV、RV、PDCoV、TGEV、PKoV、PBoV、PSV阳性率分别为62.40%、22.58%、19.35%、0%、62.40%、27.96%、25.80%。夏季共检测腹泻样品31份，PEDV、RV、PDCoV、TGEV、PKoV、PBoV、PSV阳性率分别为77.41%、45.16%、0%、0%、80.65%、9.68%、19.35%。秋季共检测腹泻样品62份，PEDV、RV、PDCoV、TGEV、PKoV、PBoV、PSV阳性率分别为54.84%、27.41%、27.41%、0%、61.29%、22.58%、40.32%。冬季共检测腹泻样品87份，PEDV、RV、PDCoV、TGEV、PKoV、PBoV、PSV阳性率分别为75.86%、16.09%、13.79%、0%、40.23%、43.68%、24.14%。据报道，PEDV具有季节流行性，大多流行于冬季和春季，但从本次研究结果来看，PEDV检出率较高的为夏季77.41%和冬季75.86。PDCoV夏季的检出率为0%，冬季的检出率也相对较低为13.79%，可见在夏季高温和冬季寒冷的气候下PDCoV的繁殖和传播得到抑制。其他病原未有明显的季节分布。TGEV在所有时间内的检出率都为0%，这也在一定程度上说明其在广东地区的分布减少甚至消失。

2.4 不同猪场腹泻病原混合感染情况分析 为了了解来源于不同猪场腹泻样品的病原感染情况，做数据统计发现，43个不同猪场单独感染腹泻病原的数量相对于混合感染极少，而且病原混合感染情况较为复杂，大多是几种病原混合感染，如中插彩版图2，其中PEDV以及PKoV的混合感染数量最多，这也证明了PEDV是当前导致猪群腹泻的主要病原。虽然PKoV在健康猪群中也能检测到，但从本次的调查结果来看，其在腹泻猪群中普遍存在。因此，PKoV与猪群腹泻的关系还需进一步的研究。目前复杂的混合感染情况也给临床防疫工作带来挑战。

3 讨论

猪的病毒性腹泻是规模化猪场的常见病和多发病，主要由PEDV、RV、TGEV引起。自2012年PDCoV在香港首次报道[2]后，多项研究证明，PDCoV感染仔猪后可引起仔猪腹泻、呕吐、脱水等症状。为了调查PDCoV在国内猪场中的流行情况，有学者对采自湖北、江苏、广东、河南、安徽等地区的2013年到2014年的258份粪便样品进行检测，PDCoV阳性率14.3%，证实了PDCoV在我国猪场中存在[3]。2007年，匈牙利科学家在10日龄腹泻仔猪粪便样品中检测到PKoV，从此开始了对猪库布病毒的研究[4]。2012年，胡军勇[5]等采集湖北省54个规模化猪场仔猪病料165份进行RT-PCR检测，结果发现，PKoV在腹泻仔猪中的感染率高达82.5%，健康仔猪中阳性率为13.23%。因此，可以推测PKoV的感染与仔猪腹泻有一定的关系。第一例猪博卡病毒(PBo-Like Virus)于2009年由瑞典科学家首次发现并报道[6]。随后，于2010年在中国首次检测出了猪博卡病毒[7]。PBoV主要在断奶仔猪中流行，目前已在中国的其他省市如江西、浙江、安徽、河北、河南、江苏、上海、北京、新疆等地区检测到，检出率在12.5%～88.9%，和PKoV一样，PBoV也能在健康猪的样品中检测到，检出率为7.3%[8]。大量的研究已证实，PBoV已在中国的规模化猪场中广泛分布。猪的萨佩罗病毒于1960年被首次报道以来，相继被英国、日本等多个国家报道。PSV感染猪只可以引起轻度或者中度的神经系统紊乱、腹泻、肺炎和繁殖障碍，也会表现出无明显特征的亚临床症状。2009年，兰道亮等[9]分离出中国首株PSV,将其命名为csh，并用动物回归试验证实该株病毒可以引起猪腹泻、呼吸障碍和神经症状。2012年，又对华东地区960份临床粪便样品进行RT-PCR检测，总阳性率为17.2%。随后有研究人员对华南地区和西南地区的PSV流行情况作了调查，阳性检出率分别为18.21%和26.6%。综合以上报道可以看出，能够导致猪腹泻的病原如PEDV、RV、TGEV、PDCoV、PKoV、PBoV、PSV已在我国规模化猪场中普遍存在。

从此次检测结果来看，PEDV总体阳性率最高，为66.7%，其次是PKoV，阳性率为56.8%。自2010-2011年以来，我国南部10个省猪场均有暴发PEDV，猪死亡数超100万头，陈建飞[10]等通过在全国采样对仔猪腹泻病因进行分析，证明从2010年12月开始的导致大规模仔猪腹泻的病因主要是猪流行性腹泻病毒。而且近年来，PEDV流行范围不断扩大，混合感染率增高[11]，本次检测中PEDV与其他病毒的混合感染占PEDV总阳性率的81.3%。从中可以看出PEDV是广东地区导致猪腹泻的主要病原。PKoV自2007年被报道后，已经被证实广泛存在于世界猪场中[4]，2015年，Fan Yang等证明PKoV作为独特的致病因子，产生腹泻和特异性病理损伤，可能导致间质性肺炎，肾病和胃肠炎[12]。由于PKoV在健康猪群中也能检测出，所以其是否与当前的猪腹泻病情相关尚无定论，但PKoV与PEDV、RV、PDCoV、PBoV、PSV的混合感染可能是疾病发生的诱导因素。调查结果显示，PKoV与PEDV的混合感染占PEDV与其他病原混合感染情况的66.2%，有学者认为PKoV和PEDV共感染仔猪时，可能通过某种分子机制，增强了PEDV[13]的感染力，从而使仔猪死亡率增加，具体机制目前还尚未可知。从检测结果中可以看到，引起猪病毒性腹泻的病原如TGEV、RV的阳性率分别为0%、23.4%，而2013年田云[14]等对广东地区猪流行性腹泻情况调查得到的结果分别为1.52%、16.06%，相较之下，TGEV阳性率下降，RV阳性率有所提高。虽然在本次调查中PDCoV总阳性率为17.2%，远远低于PEDV的检出率，值得注意的是与2015年翟少伦[15]等针对华南地区PDCoV的流行情况做的调查结果PDCoV阳性率4.4%相比，PDCoV感染率有持续升高的势头。另外，已有多篇报道显示，PBoV和PSV在国内外猪群中分布较为普遍，但其对宿主的作用机制仍不十分清楚，在生产上也相应地缺乏有效的防控措施，因此对猪群的潜在威胁不容忽视。

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InvestigationonporcinediarrheaPathogensinGuangdongprovinceform2016to2017

ZHOU Ling ， CHEN Gui-hua ， WU Zi-xian ， MAI Kai-jie ， LI Di ， WANG Sheng-yang ， MA Jing-yun ， ZHANG Xiang-bin

(College of Animal Science，South China Agricultural University ，Guangzhou 510642，China)

To evaluate the epidemic status of porcine diarrhea pathogens in Guangdong,the epidemiological investigation of diarrhea in some pig herds was conducted. In this study, 273 diarrhea samples were collected and detected by PCRor RT-PCR for diarrhea pathogens, including Porcine Epidemic Diarrhea Virus, Porcine Rotavirus, Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus,Porcine Deltacoronavirus, Porcine Kobuvirus, Porcine Bocavirus, and Porcine Sapelovirus which had been epidemic in recent years. The results showed that PEDV was still the cause of porcine diarrhea, and TGEVwas not detected. Particularly there was a high positive rate of PKoV which was only second to PEDV, Thus,the role of PKoV in porcine diarrhea is worth exploring further.

Guangdong ; porcine diarrhea ; diarrhea pathogens investigation ; PCR

ZHANG Xiang-bin

S858.28

A

0529-6005(2017)10-0003-03

2017-05-23

国家重点研发计划专项(2016YFD0501304)

周玲(1993-),女，硕士，研究方向为动物健康养殖与安全生产，E-mail：1481075258@qq.com

张祥斌，E-mail：Zhangxb@scau.edu.cn