生物原料高效转化机制以及调控规律研究进展

崔佳琦，元英进，李炳志，张大伟，刘春朝，闻建平

1.天津大学化工学院，天津 300350 2.中国科学院天津工业生物技术研究所，天津 300308 3.中国科学院过程工程研究所，北京 100190

生物原料高效转化机制以及调控规律研究进展

崔佳琦1，元英进1，李炳志1，张大伟2，刘春朝3，闻建平1

1.天津大学化工学院，天津 300350 2.中国科学院天津工业生物技术研究所，天津 300308 3.中国科学院过程工程研究所，北京 100190

非粮原料预处理过程易产生对发酵微生物有毒害作用的副产物，其对微生物生长以及目标产物的生产均产生显著抑制作用。从“生物原料高效转化过程中微生物对抑制物‘应激’机制”、“生物质高效转化过程调控体系构建”以及“多菌群混合培养过程细胞群体协同效应及调控机制”三个方面出发，揭示微生物对生物原料高效转化机制以及调控规律，为理性调控以及构建生物原料高效转化体系提供依据。

生物原料；耐受机制；高效转化；调控规律；混菌培养

近年来，以非粮等生物质为原料生产潜力巨大、环境友好的可再生新能源已成为各国学者研究的重点之一。但非粮原料生物利用却远远没有达到人们的要求，若能将其高效地转化为可利用的能源、食品和化学原料，将会对人类社会的可持续性发展起到重要的作用[1]。

目前，非粮原料糖化主要是预处理和水解，但是在此过程中会产生很多对发酵微生物有毒害作用的副产物，主要包括呋喃类、酚类及弱酸类化合物等。这些抑制剂会抑制发酵过程中微生物的生长速率、生物量以及目标产物的产量和产率，对细胞的毒害作用是非常复杂的，具有多层次、多靶点的特征[2-3]。为了消除抑制剂对微生物胁迫作用以及提高非粮原料高效利用，本文首先从生物原料高效转化过程中微生物对抑制物“应激”机制出发，阐述利用多组学方法揭示微生物对抑制剂“应激”机制；其次，为提高微生物对底物转化效率，提出构建生物质高效转化过程调控体系的方法；最后，叙述采用新型培养策略——多菌群混合培养提高微生物对底物的利用，提高相应代谢产物量，并结合多组学方法揭示细胞群体如何产生协同效应及解析调控机制。通过对上述三个方面的简要介绍，旨在为其他研究人员在探索以及解析微生物生物原料转化机制以及调控规律方面提供参考与借鉴。

1 生物原料高效转化过程中微生物对抑制物“应激”机制

为了解决生物原料低效率转化问题，需先明确生物原料高效转化过程中微生物对抑制物“应激”机制。以下着重介绍微生物耐受抑制剂胁迫机制。

1.1 代谢组学解析抑制剂胁迫下微生物“应激”机制

通过向米根霉产富马酸发酵液中添加不同浓度糠醛，研究其对米根霉产富马酸以及米根霉代谢产物的影响。文献报道[4]表明：发酵起始添加糠醛时，1.0g/L的糠醛对米根霉菌株生长影响较小，但严重影响富马酸的产量；8h添加糠醛时，其对米根霉毒害作用显著，富马酸生成基本停止；通过分析不同浓度糠醛胁迫下米根霉代谢轮廓可知，米根霉生长旺盛时添加糠醛，米根霉胞内代谢严重紊乱，木糖代谢严重受阻以及有氧呼吸被抑制，导致细胞生长以及富马酸产量受到严重抑制；同时，也发现磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇等多不饱和脂肪酸代谢途径有可能有利于米根霉细胞对糠醛的适应性；基于上述组学分析结果，分别在250mL摇瓶发酵中外源添加2.4mg卵磷脂、5.4mg肌醇和24μL大豆油，经过92h、35℃发酵，富马酸产量由5.78g/L分别提高到10.03g/L、10.05g/L和12.13g/L，增幅分别为73.5%、73.8%和110%，验证了上述组学分析的正确性。

1.2 代谢组学解析微生物耐受抑制剂相关途径以及靶点

通过建立微生物对抑制剂高效耐受驯化策略，并结合代谢组学方法研究酿酒酵母对抑制剂耐受性相关途径以及靶点。酿酒酵母与耐受性相关代谢物主要包括谷氨酸、5-氧脯氨酸、鸟氨酸、脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸、肌醇等，上述代谢物主要分布在脯氨酸合成代谢途径和肌醇代谢途径中；同时，通过单敲除酿酒酵母脯氨酸代谢关键基因PRO1、PRO2和肌醇合成关键基因INO1和INM2，可显著降低菌株对抑制剂的耐受能力；通过外部添加肌醇和脯氨酸，可显著提升菌株对抑制剂的耐受能力，因而确定脯氨酸和肌醇代谢能够增强酿酒酵母抑制剂耐受性[5]。

1.3 比较代谢组学解析“压力大分子”作用下微生物应激效应

通过向木糖发酵菌424A（LNH-ST）插入木糖还原酶基因（XR）、木糖醇脱氢酶（XDH）基因以及过表达木酮糖激酶基因（XK），结合比较代谢组学技术阐明不同来源抑制因子的作用机制以及解析细胞“压力大分子”作用下的应激效应。木糖发酵菌株中大量积累木糖，表明木糖的吸收不是限制抑制剂环境下菌株木糖代谢的关键因素。而多元醇木糖醇、甘油和半乳糖醇的含量下降暗示了木糖的分解代谢能力受到抑制，从而限制了木糖利用。同时，木糖代谢阶段，木糖发酵菌株中脯氨酸、甘氨酸、赖氨酸和谷氨酸的含量显著下降，而甘露醇大量积累[6]。

1.4 多组学结合解析抑制剂胁迫下微生物高效转化耦合机制

通过构建酿酒酵母对抑制剂耐受能力快速提升驯化策略，并结合多组学分析方法对响应底物抑制性的信号分子进行结构与功能鉴定和定量分析，从微观水平为生物原料高效转化提供耦合机制。通过建立的快速抑制剂耐受驯化策略，菌株对复合抑制剂耐受能力明显提升，发酵周期由141h缩短到21h；利用GC-TOF对微生物驯化过程中的代谢物响应进行了定量研究，发现参与糖酵解途径的代谢物变化显著，由糖酵解途径代谢物衍生的氨基酸在驯化中含量上调，由三羧酸循环代谢物衍生的氨基酸在驯化中含量明显下调；利用蛋白组学技术对驯化过程的菌株蛋白变化进行了定量研究，发现调节最显著的蛋白的功能类别为细胞代谢、能量、蛋白质合成和细胞压力响应；同时，酿酒酵母菌株在抑制剂刺激下，增强了葡萄糖代谢中的糖酵解途径、乙醇合成途径以及磷酸无糖途径，抑制了乙酸和甘油合成途径[7-8]。

2 生物质高效转化过程调控体系构建

构建生物质高效转化过程调控体系，是生物质原料高效转化的主要部分。深度解析生物产品中的复杂相互联系的代谢和调控网络，重新分配生物合成网络中关键节点的代谢流和理性补料策略开发等，对生物基化学品发展中生物质高效利用、产物高效生产及其调控有着重要的意义。以下着重介绍构建生物质高效转化过程调控体系的几类方法。

2.1 理性提高微生物相关代谢产物量

① 通过构建基因组尺度动态代谢网络模型（GSDFBA）并偶联MOMA算法，GS-MDFBA成功鉴定出三类能够显著提升FK506产量的靶点。其中HTΔgcdh-tktB/msdh/ask菌株的FK506产量最高，达到（126.61 ± 4.66）mg/L，较原始菌株提升了1.29倍[9]；通过利用GC-MS、LC-MS等研究手段动态对比菌体在两种不同培养条件下不同的代谢状态及FK506合成水平，并结合理性补料策略，FK506产量由251mg/L提高到405mg/L[10]。

② 通过13C平行标记实验、基元模式分析以及Flux Design算法预测了提高子囊霉素产量的靶基因。采用组合基因操作方法：在敲除pyc基因的基础上进一步扩增fkbO基因，获得了工程菌株TD-ΔpycfkbO，在优化发酵条件下，子囊霉素最终产量达到610 mg/L[11]。

③ 通过构建合成L-苯丙氨酸的E. coli HD-1，并结合在体外粗酶基础上滴加纯酶得出单个酶绝对浓度的方法，从而构建得到简单、有效的体外多酶反应体系，通过在出发菌株中过表达AroA，L-苯丙氨酸产量在48 h达到了62.47g/L[12]。

2.2 系统代谢工程理性调控微生物产异丁醇产量

围绕“还原力代谢角度的基因组尺度模型-预测靶点—实验验证”的系统代谢工程改造策略，研究通过调控生物转化过程中关键基因以及调控因子对微生物产相关代谢产物的影响。通过基因组尺度网络模型，联合代谢通量平衡分析方法和最小代谢调控分析方法，模拟预测得出还原力调节靶点——甘油醛-3-磷酸到1，3-二磷酸甘油酸的代谢反应；利用异源gapN通路，并采用5个不同强度的人工组成型启动子精细调控该通路NADPH合成，在最强启动子BBa_J23100调控下获得最佳异丁醇合成菌株LA09，其胞内NADPH/NADP比值在对数生长期和稳定生长期分别提高到0.67和0.64，还原力调节驱动代谢流再分配，使乙醇和乳酸产量下降至1.32g/L和6.08g/L，分别比出发菌株LA02降低了17.5%和51.7%，而异丁醇产量得以提高了2.21倍至8.68g/L[13]。

2.3 正调控LysR家族调控因子FkbR1及其靶基因提高FK520产量

通过正调控LysR家族调控因子FkbR1以及靶基因手段，对生物转化过程中关键调控因子进行改造，增强关键基因以及蛋白/酶表达水平，进而提高FK520产量。试验结果表明fkbR1基因敲除菌株DfkbR1中FK520产量比出发菌株FS35降低了67.5%；fkbR1基因过表达菌株OfkbR1中FK520产量达到了421.7mg/L，比FS35提高了33.5%；通过RT-PCR分析FK520的合成基因，fkbE、fkbF、fkbS、fkbU在OfkbR1菌株的转录水平上调，在DfkbR1菌株中下调，因此FkbR1正调控fkbE、fkbF、fkbS、fkbU的表达。下一步通过体外EMSA分析和体内ChIP分析，确定了调控因子FkbR1直接结合fkbE和fkbF的启动子，确定fkbE靶基因，由此可以得出调控因子FkbR1直接调控靶基因fkbE的转录。在此理性指导下，通过基因工程手段研究靶基因fkbE对FK520产量的影响，靶基因fkbE对FK520合成起着重要作用，且其参与乙基丙二酰辅酶A的合成，在FK520合成中具有关键作用[14]。

2.4 理性调控策略实现底物利用最大化、残糖最小化

通过不同强度启动子理性调控酿酒酵母异源木糖吸收模块表达强度，以研究微生物对木糖利用最大化、残糖浓度最小化的问题。文献报道[15]表明：通过以酿酒酵母密码子偏好为准的基因序列调控优化，构建获得异源木糖吸收模块，并采用不同强度正向调控启动子优化了异源木糖吸收模块表达强度，进而增加木糖的吸收利用，进一步强化酿酒酵母宿主中磷酸戊糖途径的多个关键基因表达；同时，辅以不同强度适应性驯化手段，增强菌株对代谢底物的适应以及利用能力，以达到菌株对底物中糖类物质的高效利用，实现了底物利用最大化、残糖最小化，达到了木糖高效代谢之目的。

3 多菌群混合培养过程细胞群体协同效应及调控机制

能源和环境危机越来越受到各国政府的重视，因此可再生能源和循环经济成为各国政府工作的重要内容。近年来，多菌群混合培养被广泛应用于能源、医药等领域产品生成过程中，并取到了丰硕的研究成果。以下着重介绍混菌培养过程细胞群体协同效应及调控机制。

3.1 解析混菌培养进化对生产能力影响机制

通过构建混菌培养体系，并结合代谢组学、蛋白质学方法研究混菌培养进化对生产能力影响的机理 。文献报道[16-18]表明：酮古龙酸杆菌和蜡状芽孢杆菌共培养，发现混菌体系在适应性进化过程中通过协同作用快速进化达到稳定状态；同时，发现混菌培养的协同作用对单菌影响显著，单菌的生长能力显著增强，对培养环境的适应能力增强；小菌的产酸能力有明显增强，而大菌的产孢能力减弱；利用代谢组学建立代谢物传递和代谢模型，发现大小菌的混合菌群培养的协同作用主要通过三个阶段完成：①营养的搜索和摄入，大菌的蛋白合成增加；②小菌的蛋白降解和氨基酸转运能力增强；③大菌提供小菌更多氨基酸和嘌呤增强小菌的氧化和能量再生。同时，利用蛋白质组学建立大小菌相互作用模型，揭示了增强混菌产2-酮古龙酸增加的原因：①大菌产孢相关蛋白降低；②大菌多肽转运蛋白增强；③小菌氨基酸合成能力增强。

3.2 混菌培养揭示底物与终产物调控变化规律

通过对酿酒酵母木糖代谢模块进行调控，研究混菌培养发酵体系提高乙醇产量，降低葡萄糖和木糖残留的变化规律。通过建立混菌培养发酵体系，包含了两种酿酒酵母：一种是含有木糖代谢调控模块的酿酒酵母（SyBE005，其通过基因工程手段进行不同强度正向调控启动子优化，增加酿酒酵母异源木糖吸收模块表达强度，增强酿酒酵母对木糖的吸收利用），另一种是耐受抑制剂能力较强的酿酒酵母[19]。利用这种新型的混菌体系，按照1∶1的接种比例，总共7.5 g/L接种量进行同步糖化共发酵。葡萄糖在0～12h被迅速消耗利用转化成乙醇，并一直保持在低浓度水平（低于5g/L），而木糖的利用并没有显著的提升（剩余的木糖浓度为15.8g/L），这表明在混菌体系中葡萄糖的利用得到了很大的提升，乙醇的浓度也从41.2g/L提升到了54.0g/L；为了进一步降低发酵体系中木糖的残留，调节了混菌体系中两菌的接种比例，木糖利用菌与抑制剂耐受菌接种比例为10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5和1∶10时，发酵体系中残余的木糖浓度分别为10.2g/L、10.1g/L、12.1g/L、15.8g/L、18.2g/L、20.8g/L和22.7g/L。从上述研究结果发现，当糖利用菌与抑制剂耐受菌接种比例为10∶1时获得了最佳发酵效果，此时木糖残余仅10.2g/L，发酵产生的乙醇浓度达到57.9g/L，相比于单菌发酵体系，乙醇浓度提高了16.1g/L[19]。

3.3 混菌培养揭示细胞群协同生长效应

通过建立热纤梭菌与嗜热解糖梭菌混菌共培养体系，研究混菌协同发酵产氢气和有机酸过程中混菌协同生长效应。热纤梭菌7072与嗜热解糖梭菌869共培养促进产氢，当嗜热解糖梭菌869与热纤梭菌7072的接种比例为0.25∶1时，氢气产量达到61.97mL/g玉米秸秆，优于单培养；通过胞外底物成分分析，可知共培养促进了玉米秸秆中纤维素和半纤维素的利用，这主要是热纤梭菌生长过程中形成的复合纤维素酶系，能够将秸秆中的部分纤维素和半纤维素水解成为单糖或糊精，有利于共培养产氢过程；胞内外代谢产物分析，可知共培养体系中嗜热解糖梭菌的接种比例增加时，发酵液中丁酸的生成量迅速增加，而乙醇和乙酸的浓度稍有降低，并且在所有接种比例的共培养发酵液中均没有检测到乳酸，乙醇生成量的降低和乳酸的消失是嗜热厌氧梭菌共培养氢气产量提高的主要原因[20]。

4 展 望

基于上述机理以及机制，未来主要工作将围绕：①利用已阐明的微生物耐受抑制剂胁迫机制，通过理性构建或修饰微生物相应代谢途径增强其对抑制剂耐受能力，达到微生物高效利用非粮原料之目的；②将构建生物质高效转化过程调控体系方法，广泛应用于工业微生物高产相应代谢产物过程中，验证其方法是否具有高效性以及普适性；③根据已有的混菌培养系统构建原理以及机制，将其广泛应用于能源、医药以及化工原料生产过程中，以到达原料低投入、产物高产出之目的。

Efficient transformation mechanism and regulation for biofeeds: a review

CUI Jiaqi1，YUAN Yingjin1，LI Bingzhi1，ZHANG Dawei2，LIU Chunchao3，WEN Jianping1
1. School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300350, China 2. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China 3. Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China

The pretreatment process of non-grain raw materials can produce byproducts that have harmful effects on microorganisms. Byproducts also have a signi fi cant inhibitory effect on microbial growth and target product production.This paper aims to state the stress mechanism of microorganisms in the process of high efficiency transformation for biofeeds, the way to construct the regulation system in the biomass ef fi cient conversion process and the synergistic effect and regulation mechanism in the co-culture, which reveal the efficient transformation mechanism and regulation for biofeeds, aiming to provide basis for rational regulation and construction high ef fi ciency conversion system to utilize the biofeeds.

biofeeds; tolerance mechanism; ef fi cient transformation; regulation; co-culture

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.06.008

闻建平，教授，研究方向：生物反应工程。2004 年，获得首届“教育部新世纪优秀人才支持计划”资助。在Biotechnology for Biofuels、Biotechnology and Bioengineering、Bioresource Technology等国际期刊发表SCI论文100 多篇。E-mail：jpwen@ tju.edu.cn

崔佳琦，博士研究生，研究方向：生物反应工程。E-mail：cuijiaqi2015@126.com

工业生物过程高效转化与系统集成的科学基础研究（2013CB733600）；生物原料高效转化机制与调控规律（2013CB733601）