基于PCR-反向点杂交法对江西地区分枝杆菌感染状况分析

吕小林 聂益军 林慧 肖婕

基于PCR-反向点杂交法对江西地区分枝杆菌感染状况分析

吕小林 聂益军 林慧 肖婕

目的了解江西地区分枝杆菌感染流行现状，为临床防治提供科学依据。方法运用PCR-反向点杂交法对345例可疑分枝杆菌感染患者不同标本进行分枝杆菌核酸检测。结果345份标本中共检出68例阳性(阳性率为19.7%)，其中结核分枝杆菌复合群(MTC)59例(占86.76%)，非结核分枝杆菌(NTM)8例(占11.77%)，混合感染(MTC/MIN)1例(1.47%)；NTM感染中检测出5种，分别为偶发/猪分枝杆菌(MFO)、戈登分枝杆菌(MGO)、胞内分枝杆菌(MIN)、龟分枝杆菌脓肿亚肿(MAB)、蟾蜍分枝杆菌(MXE)，其中以MIN为主，占5.88%；不同标本中分枝杆菌检出率不同，痰液、灌洗液、分泌物、胸水中分枝杆菌检出率分别为：31.5%、20.3%、16.0%、4.7%。结论江西地区分枝杆菌感染主要以MTC为主，且多为单一感染。

分枝杆菌；感染；PCR-反向点杂交

分枝杆菌感染引起的结核病和非结核病是严重危害人类健康的慢性传染病，在全球范围内流行，是全球重点控制的传染病之一。全球每年新发病例超过900万，约200万人死于结核病[1]。我国2009年的结核病年发病患者约为130万，仅次于印度，为世界第二大结核病高发国家[2]。近年来，非结核分枝杆菌(NTM)感染呈快速增长趋势，并已成为威胁人类健康的重要公共卫生问题[3]。由于结核分枝杆菌感染及非结核分枝杆菌病在临床特点上极其相似，但其治疗方案存在明显差异。2012年我国制订的有关分枝杆菌感染的专家共识示，在诊断及治疗分枝杆菌病前需进行分枝杆菌菌种鉴定，以便对不同分枝杆菌感染进行对症治疗[4]。因此菌种鉴定对分枝杆菌感染诊治极其重要。本研究应用PCR-反向点杂交法对我院345例疑似非分枝杆菌感染患者不同标本进行菌种鉴定，旨在报道江西地区非分杆菌流行状况，为临床诊治及制订相关防控措施提供实验室依据。

资料与方法

一、一般资料

收集2015年7月至2016年5月期间于江西省南昌大学第一附属医院就诊的疑似分枝杆菌感染的门诊及住院患者共345例，其中男性220例，女性125例，年龄1-88岁，平均年龄55.4岁。标本类型有灌洗液、痰液、胸水、腹水等。

二、仪器与试剂

ABI2700定性PCR扩增仪、水浴箱、分子杂交箱及分枝杆菌菌种鉴定基因检测试剂(亚能生物技术有限公司原装试剂)等。

三、方法

应用PCR-反向点杂交法检测22个分枝杆菌，包括耻垢分枝杆菌(MSM)、胞内分枝杆菌(MIN)、堪萨斯分枝杆菌(MKA)、龟分枝杆菌龟亚种(MCH)、海/溃疡分枝杆菌(MMA)、偶发/猪分枝杆菌(MFO)、土分枝杆菌(MTE)、不产色分枝杆菌(MNO)、结核分枝杆菌复合群(MTC)、鸟分枝杆菌(MAV)、瘰疬分枝杆菌(MSC)、龟分枝杆菌脓肿亚肿(MAB)、蟾蜍分枝杆菌(MXE)、浅黄分枝杆菌(MGI)、草分枝杆菌(MPH)、戈登分枝杆菌(MGO)、次要分枝杆菌(MTR)、胃分枝杆菌(MGA)、母牛分枝杆菌(MUA)、苏尔加分枝杆菌(MDI)、迪氏分枝杆菌(MDI)、猿猴分枝杆菌(MSI)。

1 标本处理：在各种标本中加入适量4%NaOH 37 ℃液化30min或更长时间，13000rmp离心5min，弃上清液，向沉淀中加入1mL MTB洗液，洗涤离心弃上清液，再向沉淀中50 μl MTB裂解液，沸水浴10min离心留上清液。

2 取出PCR反应管，加入已提取好的待测样品DNA 4μl按以下条件进行扩增，50℃ 2min，95℃ 10min，95℃ 45s、68℃ 60s 30cycles，95℃ 30s、54℃ 30s、68℃ 60s 30cycles，68℃ 10min，另设阳性、阴性质控。

3 杂交：将所有PCR扩增产物(约25μl)加入到装有杂交膜的杂交液管中，沸水水浴10min之后置于杂交箱中，59℃杂交1.5h。

4 洗膜：取出杂交膜，移至装有预热到59℃的洗液中，轻摇洗涤15min。

5 显色：将洗涤好的杂交膜放入1：2000的POD溶液中，室温轻摇浸泡30min，再用洗液清洗2遍，之后置于显色液中避光显色10min即可观察结果。

6 结果判读：根据杂交膜块上不同位点是否显判读分枝杆菌阴、阳性。

四、统计学分析

数据统计学分析采用SPSS17.0软件处理，分类计数资料用率来进行描述。

结 果

一、分枝杆菌菌种鉴定结果

345例患者中检出68例(19.7%)阳性共6种分枝杆菌，其中男性40例(18.2%)，女性28例(22.4%)；结核分枝杆菌复合群59例(17.1%)，非结核分枝杆菌8例(2.3%)，另外1例为混合分枝杆菌感染(0.3%)；痰液、灌洗液、分泌物、胸水各种标本中分枝杆菌检出率分别为31.5%、20.3%、16%、4.7%。(见表1)。

二、分枝杆菌分布特点

68例分枝杆菌中共包括6种类型，分别为MTC 59例(86.76%)、MFO 1例(1.47%)、MGO 1例(1.47%)、MIN 4例(5.88%)、MAB 1例(1.47%)、MXE 1例(1.47%)、MTC/MIN 1例(1.47%)，具体结果见表2。

表1 345例患者分枝杆菌检测结果

表2 68株非分枝杆菌菌种分布情况

讨 论

自1882年分枝杆菌被Koch发现以来，现已知有150多种， 分为结核分枝杆菌复合群、非结核分枝杆菌及麻风杆菌三大类，目前以结核分枝杆菌复合群及非结核分枝杆菌感染为主。分枝杆菌是引起人类慢性传染性感染的最重要的病原微生物之一，无论在发展中国家还是在发达国家，分枝杆菌感染都是影响公共卫生健康的棘手问题。高发病率、高死亡率及易传染性，迫使分枝杆菌感染倍受关注。2010年我国第五次全国结核病流行病学调查示[5]，我国现有结核病患者700万，其中非结核分枝杆菌的感染率为22.9%，明显高于2000年全国第四次结核病流行病调查的11.1%[6]。本研究分析了345例可疑分枝杆菌感染患者，结果示共68例阳性(占19.7%)，其中MTC占86.76%，NTM占11.77%，混合感染占1.47%，NTM感染率低于第五次全国调查水平，与第四次全国感染率相仿。NTM与MTC同属抗酸杆菌，有临床特征相似，故极易误诊误治[7]，而NTM对常规抗结核药具有较高的耐药性[8-9]，因此准确快速检测分枝杆菌菌种对于结核病防治意义重大。作者运用PCR-斑点杂交方法分析了345例患者不同标本中分枝杆菌感染状况，结果示男性感染40例(占18.2%)，女性感染28例(占22.4%)；不同标本中分枝杆菌检出率不同，痰液、灌洗液、分泌物、胸水中分枝杆菌检出率分别为：31.5%、20.3%、16.0%、4.7%；本次研究共发现6种分枝杆菌，其中以MTC感染为主，占86.76%，非结核分枝杆菌中以MIN为主，占5.88%，与北京[10]、上海[11]、广州[12]等报道存在一定差异，由此可见NTM感染具有明显地区差异；另外68例感染患者中只有1例混合感染，提示分枝杆菌感染以单一感染为主。

由于非结核分枝杆菌感染呈现上升趋势，且存在明显地域差异等特性，因此有必要建立准确、快速检测方法，分析分枝杆菌流行状况，为当地卫生医疗机构因地制宜地制订相应的防治措施提供依据。

[1] World Health Organization.Tuberculosis[M].Geneva:World Health Organization,2008.

[2] World Health Organization.WHO report 2009: Global Tuberculosis Control: Epidemiology, Strategy, Financing [M].Geneva:World Health Organization,2009.

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[5] 全国第五次结核病流行病学抽样调查技术指导组,全国第五次结核病流行病学抽样调查办公室.2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告[J].中国防痨杂志，2012,34(8)：485-508.

[6] 全国结核病流行病学抽样调查技术指导组.第四次全国结核病流行病学抽样调查报告[J].中华结核和呼吸杂志，2002，25(1)：3-7.

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EpidemiologyofmycobacteriainfectionbyPCR-reversedothybridizationinJiangxiarea

LVXiao-lin,NIEYi-jun,LINHui,XIAOJie
theFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China

ObjectiveTo understand the prevalence of mycobacteria infection in Jiangxi region and to provide a scientific basis for clinical prevention and treatment.MethodsThe different samples of 345 patients who suspected with mycobacteria infection were tested by PCR- reverse dot hybridization.Results68 cases were positive in 345 specimens, including 59 cases of mycobacteria tuberculous complex (MTC) (86.76%) and 8 cases of nontuberculous mycobacteria (NTM) (11.77%) and 1 case of mixed infection (MTC/MIN) (1.47%). There were 5 kinds of NTM infection detected, namely MFO, MGO, MIN, MAB and MXE respectively, and MIN was priority to others in NTM, accounted for 5.88%. The positive rate was various in different specimens, which sputum, lavage, secretions, pleural effusion positive rate was31.5%, 20.3%, 16.0%, and 4.7% respectively.ConclusionMTC and single infection are mainly types of mycobacterial infection in Jiangxi region.

mycobacteria; infection; PCR- reverse dot hybridization

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.12.032

330006 江西 南昌，南昌大学第一附属医院检验科

2016-12-30]