大株红景天注射液对脓毒症急性肺损伤小鼠肺组织核因子-κB表达的影响

张玉凤 臧宝赫 李雪 赵文静

大株红景天注射液对脓毒症急性肺损伤小鼠肺组织核因子-κB表达的影响

张玉凤1，2臧宝赫1，2李雪1，2赵文静1

目的观察大株红景天注射液对脓毒症小鼠急性肺损伤的影响及可能机制。方法将72只雄性昆明小鼠随机分为4组(n=18)：假手术组(Sham组)、急性肺损伤组(ALI组)、溶媒组(Vehicle组)、大株红景天注射液组(Sofren组)。ALI组、Vehicle组和Sofren组用盲肠结扎穿孔法制备脓毒症模型。Vehicle组和Sofren组分别于造模完成时立即腹腔注射溶媒或大株红景天注射液4 mL/kg，以后每12h一次重复给药。术后 12 h、24 h及48 h 取肺组织，行HE染色后光镜下观察肺组织病理损伤，Western blot法检测肺组织磷酸化IκBα(P-IκBα)、IκBα，磷酸化NF-κBp65(P-p65)的表达。结果与Sham组相比，ALI组及Vehicle组肺损伤加重，P-IκBα、P-IκBα/IκBα及P-p65表达明显增加(Plt;0.05)；与ALI组相比，Sofren组肺损伤轻，P-IκBα、P-IκBα/IκBα及P-p65表达明显减少(Plt;0.05)。结论大株红景天注射液减轻脓毒症小鼠急性肺损伤,其机制可能与抑制P-p65表达有关。

脓毒症；急性肺损伤；NF-κB；IκBα

急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome, ARDS)是严重感染、休克、创伤等非心源性疾病过程中，肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致急性、进行性低氧性呼吸功能不全或衰竭。临床上表现为进行性低氧血症和呼吸窘迫。ALI和ARDS是同一疾病发展的不同阶段，2012柏林定义摒弃ALI这一概念，根据氧合指数将ARDS分为轻、中、重三度[1]，但在动物模型中仍然沿用ALI这一概念。ARDS病因复杂，在众多致病因素中，脓毒症导致的ARDS发病率高、死亡率高，危害大[2]。研究表明大株红景天注射液改善老年感染性休克及特发性肺纤维化患者动脉血氧分压[3-4]。但具体分子机制尚不明确，本文从动物实验角度探讨大株红景天注射液对脓毒症致急性肺损伤的影响及可能机制。

资料与方法

一、实验动物、药品及主要试剂

清洁级雄性昆明小鼠72只，8-10周龄，体重30-35g，由徐州医科大学实验动物中心提供；大株红景天注射液(批号：1001161001，通化玉圣药业有限公司，中国)；磷酸化NF-κBp65抗体、磷酸化IκBα抗体、IκBα抗体、及β-Tubulin内参购自巴傲得生物科技有限公司。

二、动物分组和模型制备

健康昆明雄性小鼠72只，购自徐州医科大学实验动物中心。按随机数字表法随机分为4组(n=18)： Sham组、ALI组、Vehicle组、Sofren组。盲肠结扎穿孔致脓毒症模型参照文献[5]。具体步骤：腹腔注射10%水合氯醛3mL/kg麻醉小鼠,仰卧位固定，沿腹正中线作1.5 cm切口。开腹后找到盲肠，在距盲肠末端1cm处结扎，用21G针头穿通远端肠壁两次形成盲肠漏，然后将盲肠还纳腹腔，逐层缝合。Sham组切开腹腔取出盲肠后还纳并缝合，ALI组、Vehicle组和Sofren组采用盲肠结扎穿孔法制备脓毒症模型。Vehicle组、Sofren组术毕分别腹腔注射双蒸水、大株红景天注射液4mL/kg,以后按每12小时一次重复给药。

三、小鼠一般情况观察

术后观察小鼠活动、饮食、精神及呼吸等。

四、肺组织HE染色后病理学观察

取肺组织10%甲醛固定24h,常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后行HE染色，于光学显微镜下观察肺病理组织损伤。

五、肺组织P-IκBα、IκBα、P-p65 蛋白测定

取肺组织制备匀浆，提取细胞核蛋白及细胞浆蛋白：细胞浆蛋白用于P-IκBα和IκBα的测定，细胞核蛋白用于P-p65的测定。用Western blot法 检测蛋白，蛋白样品经电泳、转膜、封闭、加一抗4℃孵育过夜，漂洗，加二抗室温孵育2h，漂洗后，用BCIP/NBP碱性磷酸酯酶试剂盒显色，采用Image J图像分析系统定量分析。

六、统计学方法

结 果

一、一般情况

Sham组小鼠精神状况及活动佳，饮食摄水正常，呼吸平稳。 ALI组及Vehicle组小鼠造模12h后出现倦怠、寒颤、竖毛、少动少食、腹泻、眼角渗出物、脓性尿、口唇发绀、呼吸困难等表现。

二、肺组织病理学观察

各组小鼠肺组织HE染色后光学显微镜下观察：术后12、24及48 h，Sham组肺组织结构完好，肺泡清晰(见图1A、1E、1I)；ALI组和Vehicle组肺组织病理变化明显，可见肺泡破裂融合，肺泡间隔增厚，肺泡间隔及肺泡内炎症细胞聚集(见图1B、1F、1J，图1C、1G、1K)；与ALI组相比，Sofren组肺泡结构破坏减轻，炎症细胞浸润明显减少，肺泡间隔未见明显增厚(见图1D、1H、1L)。

图1 小鼠肺组织病理学改变(HE染色×200)

注： A-D为术后12h：A:Sham组,B:ALI组,C:Vehicle组,D:Sofren组; E-H为术后24h：E:Sham组,F:ALI组,G:Vehicle组,H:Sofren组; I - L为术后48h：I :Sham组,J:ALI组,K:Vehicle组,L:Sofren组。

三、 肺组织P-IκBα、P-p65蛋白表达变化

术后同一时间点，与Sham组相比，ALI组和Vehicle组P-IκBα、P-IκBα/IκBα及P-p65表达明显增加(Plt;0.05)；与ALI组相比，Sofren组P-IκBα、P-IκBα/IκBα及P-p65表达明显减少，Plt;0.05(见图2-4)。

图2 术后12h P-IκBα、IκBα及P-p65蛋白表达变化

注：与Sham组比较*Plt;0.05；与ALI组比较，#Plt;0.05

图3 术后24h P-IκBα、IκBα及P-p65蛋白表达变化

注：与Sham组相比*Plt;0.05；与ALI组相比，#Plt;0.05

图4 术后48h P-IκBα、IκBα及P-p65蛋白表达变化

讨 论

脓毒症是感染引起的全身炎症反应综合征，是导致急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的最常见病因。程晓明等[6]调查发现全身性感染是间接肺损伤的首要原因，近年来尽管抗感染治疗和器官功能支持取得长足进步，但脓毒症导致ARDS死亡率远高于其他病因引起的ARDS，高达40.6%[2]。中心粒细胞肺内聚集和活化、炎症介质释放、氧化应激是ARDS的重要发病机制。研究发现氧化应激在ARDS发生发展中发挥重要作用，主要表现为促进肺泡上皮细胞及肺血管内皮细胞凋亡，从而导致肺泡毛细血管屏障功能障碍[7-8]。此外，NF-κB活化在肺血管内皮细胞及Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡中起重要作用[9-11]，同时氧化应激与NF-κB活化又可相互促进。

NF-κB/Rel是一种重要的转录因子，有5种Rel亚基：Rel(cRel)、RelA(p65，NF-κB3)、RelB和p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)[12]。NF-κB是由这5种亚基构成的同源或异源二聚体蛋白，P50- p65异二聚体是NF-κB最主要的二聚体形式；IκBα与NF-κB结合，抑制NF-κB转位进入胞核。静息状态下NF-κB二聚体与IκBα结合以非活性形式存在于细胞质中[13]。在LPS、TNF-α、IL等刺激下，IκBα特定位点的丝氨酸残基磷酸化、随后范素化并降解，NF-κB暴露出核定位信号区，转位进入胞核与特定目DNA序列结合，启动相关基因的转录[12]。

大株红景天注射液是从大株红景天中提取的中药注射液。既往研究表明红景天具有抗氧化、抗凋亡、抗疲劳、心肌保护、改善认知功能、抗抑郁、调节免疫、抗增殖等药理作用[14-20]。其抗氧化、抗凋亡及免疫调节作用可能对脓毒症所致ARDS具有保护作用，因此本实验选择大株红景天注射液，研究其对脓毒症小鼠急性肺损伤的作用。大株红景天注射液的主要有效成分是红景天苷、酪醇、红景天芬(又称络塞维)、红景天任(又称络塞琳)等，体外实验证实这四种成分均具有较强抗氧化能力，其中红景天苷和酪醇具有明显羟自由基清除作用[21]。Rahman等[22]发现氧化应激可以促进NF-κB的活化，进而影响IL-1、IL-6、TNFα等促炎基因的表达。本实验研究结果显示大株红景天注射液减轻脓毒症小鼠急性肺损伤症状及肺组织病理学变化。盲肠结扎穿孔后小鼠肺组织胞浆蛋白P-IκBα表达增强，P-IκBα/IκBα增加，同时细胞核蛋白P-p65表达增加。腹腔注射大株红景天注射液后，肺组织胞浆蛋白P-IκBα蛋白表达减少，P-IκBα/IκBα下降，细胞核蛋白P-p65表达减少。这些结果提示脓毒症早期大株红景天注射液可能是通过抑制NF-κB的活化，减轻脓毒症相关急性肺损伤。

[1] Ranieri VM,Rubenfeld GD,Thompson BT,et al.Acute respiratory distress syndrome: the Berlin Definition[J].JAMA,2012,307(23):2526-2533.

[2] Rubenfeld GD,Caldwell E,Peabody E,et al.Incidence and outcomes of acute lung injury[J].N Engl J Med,2005,353(16):1685-1693.

[3] 郭琳娜,董国岭,王英杰,等.大株红景天注射液治疗老年感染性休克23例疗效观察[J].河北中医,2013,35(7):1041-1043.

[4] 杨洁.大株红景天注射液治疗特发性肺纤维化的临床研究[J].中医临床研究,2014,6(17):8-9.

[5] Rittirsch D,Huber-Lang MS,Flierl MA,et al.Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture[J].Nat Protoc,2009,4(1):31-36.

[6] 程晓明,朱波,张彦琦,等.急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征604例临床分析[J].中国现代医学杂志,2004,14(15):132-135,137.

[7] Zhang Y,Zhang X,Rabbani ZN,et al.Oxidative stress mediates radiation lung injury by inducing apoptosis[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,2012,83(2):740-748.

[8] Kratzer E,Tian Y,Sarich N,et al.Oxidative stress contributes to lung injury and barrier dysfunction via microtubule destabilization[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2012,47(5):688-697.

[9] 吴炜景,李理,袁伟锋,等.NF-κB p65基因在TNF-α诱导的肺泡上皮细胞氧化损伤中的作用[J].中国呼吸与危重监护杂志,2012,11(1):46-51.

[10] 李磊,汤耀卿,纪玉宝,等.NF-κB对内毒素诱导的血管内皮细胞凋亡的影响[J].中国微循环,2009,13(1):22-24.

[11] 黄英,刘国祥.肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡在急性肺损伤中的作用[J].中国现代医学杂志,2002,12(3):35-37.

[12] Karin M,Ben-Neriah Y.Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity[J].Annu Rev Immunol,2000,18:621-663.

[13] Gilmore TD.The Rel/NF-κB signal transduction pathway: introduction[J].Oncogene,1999,18(49):6842-6844.

[14] Panossian A,Wikman G,Sarris J.Rosenroot (Rhodiola rosea): traditional use, chemical composition, pharmacology and clinical efficacy[J].Phytomedicine,2010,17(7):481-493.

[15] Tan CB,Gao M,Xu WR,et al.Protective effects of salidroside on endothelial cell apoptosis induced by cobalt chloride[J].Biol Pharm Bull,2009,32(8):1359-1363.

[16] Punja S,Shamseer L,Olson K,et al.Rhodiola rosea for mental and physical fatigue in nursing students: a randomized controlled trial[J].PLoS One,2014,9(9):e108416.

[17] Zhu L,Wei T,Chang X,et al.Effects of Salidroside on Myocardial Injury In Vivo In Vitro via Regulation of Nox/NF-κB/AP1 Pathway[J].Inflammation,2015,38(4):1589-1598.

[18] Lai W,Zheng Z,Zhang X,et al.Salidroside-Mediated Neuroprotection is Associated with Induction of Early Growth Response Genes (Egrs) Across a Wide Therapeutic Window[J].Neurotox Res,2015,28(2):108-121.

[19] Amsterdam JD,Panossian AG.Rhodiola rosea L. as a putative botanical antidepressant[J].Phytomedicine,2016,23(7):770-783.

[20] Recio MC,Giner RM,Máez S.Immunmodulatory and Antiproliferative Properties of Rhodiola Species[J].Planta Med,2016,82(11-12):952-960.

[21] 马天翔,史宁,陈乾,等.红景天中8种成分体外抗氧化作用的比较[J].中国药理学通报，2012,28(9):1224-1228.

[22] Rahman I,Marwick J,Kirkham P.Redox modulation of chromatin remodeling: impact on histone acetylation and deacetylation,NF-kappaB and pro-inflammatory gene expression[J].Biochem Pharmacol,2004,68(6):1255-1267.

EffectofsofreninjectiononNF-κBexpressioninacutelunginjurymicewithsepsis

ZHANGYu-feng,ZANGBao-he,LIXue,ZHAOWen-jingDepartment
Anesthesiology,theAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalUniversity,Xuzhou,Jiangsu221009,China

ObjectiveTo observe the effect of sofren injection on septic acute lung injury in mice and its mechanism.Methods72 male Kunming mice were randomly divided into 4 groups (n=18): the sham group, the ALI group, the vehicle group, and the sofren injection group. Sepsis model was established by cecal ligation and puncture (CLP) in the group ALI, vehicle and sofren. In the group vehicle and sofren, 4mL/kg vehicle or sofren injection were intraperitoneally injected respectively after operation, followed by administration q12h. At 12, 24 and 48 h after operation, the whole lung were removed to observe the lung pathological damage after hematoxylin-eosin staining, and to detect the expression of P-IκBα, IκBα and NF-KBp65 (using Westen blot) in lung tissues.ResultsAs compared with the sham group, the pathological damage of lung and the level of P-IκBα, P-IκBα/IκBα and P-IκBα at 12, 24 and 48 h after operation were significantly increased in the ALI group (Plt;0.05). Compared with the ALI group, the pathological damage of lung and the level of P-IκBα, P-IκBα/IκBα and P-IκBα at each time were significantly decreased in the sofren group (Plt;0.05).ConclusionSofren injection inhibits the expression of P-p65, thus protects sepsis-induced ALI in mice.

sepsis; acute lung injury (ALI); NF-κB; IκBα

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.12.005

江苏省 2009年度quot;六大人才高峰quot;D类资助项目(No 2009059)

1.221009 江苏 徐州，徐州医科大学附属医院 2.221009 江苏 徐州，江苏省麻醉学重点实验室

赵文静，Email:zhaowj886@sina.com

2017-04-07]