金属硫蛋白基因G-201A多态性与原发性高血压的相关性

念 馨 刘 凯 张旭祥 李 红 刘 华

(昆明医科大学第一附属医院内分泌科，云南 昆明 650032)

·心、脑血管及代谢性疾病·

金属硫蛋白基因G-201A多态性与原发性高血压的相关性

念 馨 刘 凯1张旭祥 李 红 刘 华2

(昆明医科大学第一附属医院内分泌科，云南 昆明 650032)

目的探讨金属硫蛋白(MT)基因家族中的MT4基因G-201A位点单核苷酸多态性(SNPs)与云南地区汉族人群中原发性高血压的相关性。方法选取原发性高血压患者301例，正常对照组301例。应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析技术检测MT4基因G-201A位点的基因多态性。结果原发性高血压组、正常对照组MT4 G-201A基因型GG、GA、AA的频率分别为42.2%、48.5%、9.3%；42.5%、51.5%、6.0%；基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(Pgt;0.05)。MT4 G-201A多态性：原发性高血压组和正常对照组比较分布无显著差异(Pgt;0.05)；等位基因频率分布无显著差异(Pgt;0.05)。两组男性基因型及等位基因频率分布均有统计学差异(Plt;0.05)；回归分析示年龄、性别、体重指数(BMI)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总胆固醇(TC)、尿酸(UA)与原发性高血压的发生相关(Plt;0.05)，等位基因A携带者(GA+AA型)与原发性高血压的发生无相关性(Pgt;0.05)。原发性高血压组与正常对照组比较，年龄、BMI、甘油三酯(TG)、HDL-C、LDL-C、UA有统计学差异(Plt;0.05)。原发性高血压组中GG组与AA组比较，性别、TC有统计学差异(Plt;0.05)。结论MT基因G-210A多态性与原发性高血压无相关性；等位基因A携带者与原发性高血压的发生无相关性；MT基因G-201A多态性与脂代谢相关，GG组有较高的TC。

金属硫蛋白基因;多态性;原发性高血压

原发性高血压(EH)都是由遗传因素和环境因素共同所致，如遗传因素、氧化应激、肥胖、胰岛素抵抗。EH易感基因关联是近20年来人类高血压研究的主要方向之一〔1,2〕，虽然EH易感基因效应一般都很小，但其研究结果对阐释EH病因和提高防治手段均有非常重要意义。目前发现了血管紧张素原、醛固酮合成酶、内皮型一氧化氮合酶等〔3～5〕易感基因通过肾素血管紧张素醛固酮系统、内皮系统等影响EH的发生发展。金属硫蛋白(MT)具有多样生理功能，包括体内必需金属元素的储存、代谢和转运及重金属的解毒、自由基的清除并参与机体的应激反应、胚胎发育和细胞代谢调控、内分泌系统的调节、肿瘤的形成等。Beattie等〔6,7〕研究表明MT与能量代谢有关。国外研究〔8,9〕显示，对自发性高血压大鼠(SHR)模型进行游泳训练8 w后发现，与对照组相比，经过游泳训练的SHR主动脉MT含量升高，且心脏收缩压下降，提示内源性MT具有降低血压的作用。本文采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析技术，分析MT基因单核苷酸多态性(SNPs)与EH的相关性。

1 材料与方法

1.1一般资料 2012年10月至2013年12月昆明医科大学第一附属医院体检中心的体检人群，正常对照组301例，平均年龄(48.94±16.37)岁，无糖尿病、高血压家族史，无糖、脂代谢异常。EH组301例，平均年龄(62.87±12.61)岁，无糖尿病，选自心脏内科住院患者，均为云南地区长期居住(gt;10年)的汉族人群，无血缘关系。

1.2标本采集及DNA提取 研究对象禁食8～10 h后清晨空腹采集静脉血液样本用于测定空腹血糖(FPG)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、尿酸(UA)等生化指标；EDTA抗凝管采集4 ml静脉血保存于-20℃冰箱用于基因组DNA提取。采用小量全血基因组DNA快速提取制剂盒(北京博迈德科技发展有限公司)提取，收集到的DNA放置在-20℃。使用紫外光分光光度计，自动计算出所提取的DNA的纯度。

1.3临床资料采集 收集研究对象的姓名、性别、年龄及病史，并测量以下项目：身高、体重、腰围、臀围、血压，计算体重指数(BMI)。

1.4目的基因的扩增

1.4.1MT4引物设计 上游引物：5′-ACTCCATCTCCATCCTCACG-3′；下游引物：5′-TTACAGACGTGAGCCACTGC-3′(上海捷瑞生物工程有限公司)。扩增片段长度：198 bp。

1.4.2PCR反应体系的组成 总体系25 μl，模板DNA4.5 μl，上游引物(20 mmol/L)1.0 μl，下游引物(20 mmol/L)1.0 μl，2倍Taq PCR Master Mix(北京百泰克生物技术有限公司)12.5 μl，灭菌纯水6.0 μl。将反应体系点离心2 s后放在基因扩增仪中(美国Bio-Rad公司)。PCR反应条件：①94℃、5 min；②96℃、45 s，60℃、55 s，72℃、40 s，共5个周期；③95℃、45 s，58℃、55 s，72℃、40 s，共10个周期；④94℃、45 s，56℃、55 s，72℃、40 s，共30个周期；⑤72℃、10 min。

1.4.3PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定 凝胶槽放入装有缓冲液的电泳槽中，将PCR产物10 μl和6倍上样缓冲液2 μl均匀混合，小心加入加样孔中，以5 μl 50 bp Marker作为分子量标准，加样端连接负极。在100 mV电压下电泳30 min。电泳结束后用Tanon 3500紫外图像分析系统观察198 bp的产物片段。

1.4.4PCR 产物的酶切 限制性内切酶Xcel(Nspl)(Thermo公司)的酶切位点为：5′…R C A T G↓Y…3′；3′…Y↑G T A C R…5′，MT4 201G-A由于 MT4基因201位点由A代替G，Xcel限制性内切酶位点消失。PCR扩增目的基因为198 bp，经Xcel限制性内切酶消化后，获得的酶切片段长度分别为107 bp和91 bp，可产生三种基因型，分别为纯和切开型(GG),纯和未切开型(AA)，杂合切开型(GA)。

1.4.5酶切产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序 凝胶槽放入

装有缓冲液的电泳槽中，将酶切产物10 μl小心加入加样孔中，以5 μl 50 bp Marker作为分子量标准，加样端连接负极。在90 mV电压下电泳50 min。电泳结束后用Tanon 3500紫外图像分析系统(天能科技上海有限公司)观察107 bp、91 bp的产物片段，由此判断基因型。抽取样本各2份进行测序分析，验证其基因型。

1.5统计学方法 采用SPSS17.0软件进行χ2及t检验，Logistic回归分析。

2 结 果

2.1MT 4基因分析 目的基因MT4的PCR扩增产物片段长度198 bp，扩增产物的量、纯度及特异性均好，适合下一步进行PCR产物的酶切及琼脂糖凝胶电泳测定，见图1。

2.2MT4基因G-201A酶切产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果 MT4基因PCR扩增产物经Xcel限制性内切酶酶切后，获得的酶切片段长度分别为107 bp和91 bp，可产生三种基因型，分别为GG、AA及GA，见图2，图3。

M：Marker；1～6：MT4的PCR扩增产物图1 MT4基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳

M：Marker;1～3：GA；4、6：GG；5：AA图2 MT4基因G-201A酶切产物琼脂糖凝胶电泳

GA基因型

GG基因型

AA基因型

2.3MT4基因G-201A基因型和等位基因分布频率比较 MT4基因G-201A位点检测到GG、GA和AA 3种基因型，基因型频率分布符合Hardy-Weinberg 平衡检验。EH组和正常对照组GG、GA和AA基因型及G和A等位基因频率分布均无统计学差异(Pgt;0.05)。同性别EH组和正常对照组间GG、GA和AA基因型及G和A等位基因频率分布也均无统计学差异(Pgt;0.05)。见表1。

2.4Logistic回归分析 年龄、性别、BMI、HDL-C、LDL-C、TC、UA与EH的发生有明显相关性(Plt;0.05)；年龄越大，女性，

表1 两组G-201A基因型及等位基因频率比较〔n(%),n=301〕

BMI、LDL-C、UA越高，HDL-C越低，患EH的危险性越大；等位基因A携带者(GA+AA型)、TG与EH的发生无相关性(Pgt;0.05)。见表2。

2.5各组临床特点和生化指标比较 EH组HDL-C明显低于正常对照组，BMI、TG、LDL-C、CA明显高于正常对照组(Plt;0.05)，性别、FPG、TC两组无统计学差异(Pgt;0.05)。EH中GG组与(GA+AA)组、GA组相比，年龄、性别、BMI、FPG、TC 、TG、HDL-C、LDL-C、UA无统计学差异(Pgt;0.05)；GG组与AA组比较，性别、TC有统计学差异(Plt;0.05)。见表3。

表2 EH发生相关危险因素的Logistic回归分析

表3 两组临床特点和生化指标比较

与正常对照组比较：1)Plt;0.001，2)P=0.038，3)Plt;0.001，4)P=0.001，5)Plt;0.001；与GG组比较：6)P=0.027,7)P=0.046

3 讨 论

目前已知的与儿茶酚胺代谢有关的酶类及调节血压的某些生物活性物质均含有金属元素，并与铜、锌在体内的平衡有关，推测MT可作为铜、锌等金属的供体，通过调节体内微量金属平衡的作用，调节高血压的发生发展。MT相对分子质量为7 kU左右，为低分子量蛋白质，是由60～63个氨基酸残基组成一条多肽单链，不含芳香族氨基酸及组氨酸，富含半胱氨酸。根据其部分氨基酸及所带电荷不同，MT分为4种亚型，即MT1、MT2、MT3和MT4。MT1和MT2在大多数哺乳动物的器官中广泛存在，是MT在体内的主要形式，发挥重要作用〔10〕。MT3特异性分布于中枢神经系统及雄性小鼠的生殖系统；MT4仅在复层鳞状上皮中表达〔7〕，目前对MT4的研究资料较少。MT分子具有特殊的化学结构，分子中还原状态的巯基具有亲和性，其中的金属具有动力学不稳定性，这使得MT极易与某些亲电性物质作用，特别是能与自由基结合，对羟自由基、氧自由基及一氧化氮(NO)等自由基有较强的清除作用，其清除羟自由基能力是还原性谷胱甘肽(GSH)的300倍〔11〕。MT还可以显著抑制氧化应激导致的脂质过氧化终产物丙二醛的生成〔12〕。研究表明几乎在所有过氧化状态下，MT基因的表达均上调，这些都表明MT参与机体的抗氧化应激和细胞保护〔13，14〕。

本研究发现MT基因G-201A多态性与EH无相关性；且等位基因A携带者与EH的发生无相关性，MT基因G-201A多态性与脂代谢相关。

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〔2016-05-27修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

R544.1

A

1005-9202(2017)21-5275-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.025

国家自然科学基金地区科学基金项目(81660153)；云南省应用基础研究(昆医联合专项)〔2017FE468(-197)〕；云南省卫生厅内设机构项目(No.2012WS0030)

1 郑州市中心医院内分泌科

2 昆明医科大学第一附属医院检验科

张旭祥(1972-)，男，副主任医师，主要从事糖尿病并发症发病机制研究。

念 馨(1975-)，女，副主任医师，硕士，主要从事糖尿病发病机制及相关并发症研究。