穴位埋线对血管性痴呆大鼠海马CA1区p53蛋白表达的影响

李 霞 唐中生 吴春朋 谢高宇 陆 莹 罗亚非

(贵阳护理职业学院基础护理教研室,贵州 贵阳 550081)

穴位埋线对血管性痴呆大鼠海马CA1区p53蛋白表达的影响

李 霞 唐中生1吴春朋1谢高宇1陆 莹1罗亚非1

(贵阳护理职业学院基础护理教研室,贵州 贵阳 550081)

目的观察穴位埋线对血管性痴呆(VD)大鼠海马CA1区p53蛋白表达的影响。方法取SD大鼠随机分成假手术组、VD模型组、穴位埋线组、尼莫地平组，采用改良的Pulsinelli四血管闭塞法(4-VO)建立VD大鼠模型，两个治疗组分别施行穴位埋线和尼莫地平治疗，连续15 d。水迷宫行为学测试后，断头处死大鼠，采集海马CA1区，用免疫组织化学法检测其p53表达，并取大脑皮质做冠状位病理切片进行HE染色，观察并比较各组大鼠海马CA1区p53和大脑皮质神经元损伤程度。结果假手术组海马CA1区未见p53阳性细胞，穴位埋线组及尼莫地平组海马CA1区p53阳性细胞平均灰度值均明显高于VD模型组(Plt;0.05)，大脑皮质神经元的损伤和变性减轻且数量增加。结论穴位埋线可明显降低海马CA1区p53蛋白的表达，抑制VD大鼠脑损伤引起的细胞凋亡，对脑组织起保护作用，这可能是其治疗VD的作用机制之一。

穴位埋线；血管性痴呆；p53；海马

血管性痴呆(VD)是指各种脑血管疾病引起的脑功能障碍而产生的获得性智能损害综合征，为一慢性进行性疾病〔1〕。 针灸治疗VD疗效肯定，副作用少，可明显减轻痴呆症状、改善学习和记忆〔2,3〕。作为针灸疗法的分支，穴位埋线疗法已经广泛应用于临床各科〔4〕。研究表明〔5〕，穴位埋线可改善VD大鼠学习记忆能力。在此基础上，我们制备VD大鼠模型，采用穴位埋线治疗，探讨VD发病与海马CA1区p53蛋白表达的关系。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康雄性SD大鼠70只，体重280～300 g，清洁级，由重庆滕鑫比尔实验动物销售有限公司提供，许可证号：SCXK(渝)2012-0005。

1.2实验器材 可吸收性外科缝线(经络疏通专用线，中国中医研究院众益科技开发公司)；华佗牌1.5寸毫针(苏州医疗器械厂)；电子天平(巨天仪器设备有限公司，ES200)；微型动脉夹(安徽淮北正华生物仪器设备有限公司)；SDQ-30双极射频电凝器(苏州手术器械厂)。

1.3药品与试剂 10%水合氯醛(天津市永大化学试剂有限公司)；尼莫地平片(正大青春宝药业有限公司，批号：0801002)；4%多聚甲醛、p53免疫组化检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.4VD大鼠模型的建立 采用改良Pulsinelli四血管阻断法(4-VO)建立VD大鼠模型〔6〕。按随机数字表法将已经制备成功的VD模型大鼠分为VD模型组、穴位埋线组和尼莫地平组，除去治疗过程中死亡的大鼠，保证每组至少10只。另设假手术组10只作对照，处理步骤同上，但不进行椎动脉烧灼和颈总动脉夹闭。四个组的治疗时间和治疗方法按课题组之前的方法进行〔5〕。

1.5标本制作及检测 用10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉大鼠，迅速开胸暴露心；经升主动脉插管后，先用100 ml生理盐水快速冲洗，随后用4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液(pH7.4)灌流约1 h；灌注完毕后迅速开颅取出完整大脑,剥离脑膜,用镊子从矢状缝将皮质向两边分,先取海马放入4%多聚甲醛固定，依次酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋。连续冠状切片，片厚5 μm，进行p53免疫组织化学染色〔二氨基联苯胺(DAB)染色〕。后取额叶部大脑皮质，连续冠状切片，片厚5 μm，进行HE染色。

1.6p53蛋白图像分析 p53阳性细胞主要表达于细胞核，着色呈棕黄色。运用图像分析系统测定各组海马CA1区p53蛋白阳性反应物的平均灰度值(平均灰度值0～255，其值越大，表达水平越低)。

1.7统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行ANOVA分析，两两比较采用LSD检验。

2 结 果

2.1各组大脑皮质神经元病理学观察 假手术组大脑皮质神经细胞排列紧密，细胞边缘清晰，未见神经元变性和坏死，胞质染色均匀，核圆而大，核仁、核膜清晰，有轻微水肿和神经元肿胀，无胶质细胞增生和淋巴细胞浸润。VD模型组大脑皮质局部出现水肿，神经元中度肿胀、变性和坏死，体积增大，细胞稀疏，细胞质染色变浅及尼氏体消失，细胞核体积增大，染色变浅，胶质细胞增生形成结节，无淋巴细胞浸润。穴位埋线组大脑皮质见轻微组织水肿和神经元肿胀，神经元无变性和坏死，无胶质细胞增生和淋巴细胞浸润。尼莫地平组大脑皮质水肿明显减轻，神经元轻微肿胀，神经元轻度变性和坏死，核固缩现象减轻，胶质细胞轻度增生。见图1。

2.2各组海马CA1区神经元p53表达 见图2。假手术组未

图1 各组大脑皮质冠状切片(HE，×400)

图2 各组海马CA1区p53阳性表达(DAB，×400)

见p53阳性细胞，其平均灰度值(191.39±5.13)，是其背景的非特异性反应；其余各组均可见p53阳性细胞，镜下免疫反应产物呈棕黄色，主要表达于细胞核，少量表达于胞质。VD模型组平均灰度值(144．28±10．33)，穴位埋线组(186.21±2.25)，尼莫地平组(177.12±2.06)。VD模型组平均灰度值明显低于假手术组(Plt;0.01)；与VD模型组平均灰度值比较，穴位埋线组明显增设 (Plt;0.05)，穴位埋线组平均灰度值与尼莫地平组无明显差异(Pgt;0.05)。

3 讨 论

研究认为海马CA1区神经细胞凋亡可能是VD重要的发病机制和病理基础〔7〕。p53是一种促凋亡基因，在正常组织中的表达极低，p53及其相关基因在脑缺血中的表达与调控，是神经元凋亡的关键环节。研究表明，脑损伤可导致p53的表达增加〔8〕，抑制p53的表达对脑缺血组织具有保护作用〔9〕。p53还能减少Bcl-2蛋白的表达，增强Bax蛋白表达，并调节Bax、caspase等系列下游基因而促进神经细胞凋亡〔10〕，表明p53基因具有促进神经细胞凋亡的作用。有研究发现，p53蛋白表达增加参与了大鼠脑创伤后神经细胞的DNA断裂〔11〕，在脑创伤后的大鼠海马区凋亡的神经细胞中检测到p53 mRNA〔12〕。Martin等〔13〕也认为大鼠脑创伤后p53蛋白表达增加，可能通过调整Bax蛋白表达促进神经细胞凋亡。本文结果提示穴位埋线治疗后大鼠p53蛋白表达明显下降。穴位埋线是在中医理论指导下，将可吸收性外科缝线置入穴位内，利用线对穴位产生的持续性刺激作用以防治疾病的方法〔14〕。中医认为，气行则血行，血行则髓生，气血调和，百病不生。痴呆患者多属本虚标实，气滞血瘀。取百会、膈俞、气海、三阴交(双)、膻中组成益气活血方，探索穴位埋线对缺血性脑血管病的作用机制，五穴组合，共奏益气活血之功。关建军等〔15〕研究表明，针灸益气活血法可明显改善VD大鼠学习记忆能力，降低海马真性胆碱酯酶(T-chE)含量，可显著提高VD大鼠大脑皮质CA1区的突触数密度和突触活性区的面积密度〔16〕，还可提高VD大鼠海马组织中SOD活性及降低MDA含量〔17〕。本文结果提示穴位埋线通过下调VD大鼠海马CA1区p53蛋白的表达，抑制了VD大鼠脑损伤引起的细胞凋亡，对VD大鼠脑组织起到了保护作用，这可能是其治疗VD的作用机制之一。

1Wahlund LET，Gauthier S.Vascular cognitive impairment in clinical practice〔M〕.Cambridge,UK：Cambridge University Press,2009:301-10.

2张 俊，王天锡.针灸治疗血管性痴呆的实验研究及临床进展〔J〕.内蒙古中医药，2014;4(1)：122-3.

3罗梅桂，罗本华.针灸治疗血管性痴呆的机理研究进展〔J〕.广西中医药大学学报，2014;17(4)：97-9.

4蒙 珊,吕计宝,文小江.穴位埋线疗法临床应用近况〔J〕.山西中医,2012;28(2):56-8.

5唐中生，谢高宇，陆 莹，等.穴位埋线对血管性痴呆大鼠学习记忆能力及血清白介素-1β、肿瘤坏死因子-α表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2014;34(22)：6407-9.

6李文东，姜洪波，连晓倩，等.Pulsinelli四血管法大鼠全脑缺血模型制作方法的改进〔J〕.新乡医学院学报，2010;27(3):237-9.

7Fang M,Li J,Tiu SC,etal.N-methyl-D-aspartate receptor and apoptosis in Alzheimer disease and multiinfarct dementia〔J〕.Neurosci Res,2005;81(2):269-74.

8Khocjbin S,Lawrece JJ.Processing of p53mRNA during induced differentiation of murine erythrolinkimia cells:is an altered splicing medianism responsible for the post transcriptional control of gene expression〔J〕.Gene,1998;72:177-85.

9Morrison RS,Kinoshita Y,Johnson MD,etal.p53-dependent cell death signaling in neurons〔J〕.Neurochem Res,2003;28(1):15.

10苏 方，张 培，姜治伟，等.海马神经元缺血/再灌注后自噬的表达及其作用〔J〕.中国应用生理学杂志，2011;27(2)：187-90.

11Lu J,Moochhala S,Kaur C,etal.Changes in apoptosis-related protein(p53，Bax，Bcl-2 and Fos)expression with DNA fragment in the central nervous system in rats after closed head injury〔J〕.Neurosci Lett,2000;290(2)：89-92.

12McCullers DL，Sullivan PG,Scheff SW,etal.Mifepristone protects CA1 hippocampal neurons following traumatic brain injury in rat〔J〕.Neuroscience,2002;109(2)：219-30.

13Martin LJ,Kaiser A,Yu JW,etal.Injury-induced apoptosis of neurons in adult brain is mediated by p53-dependent and p53-independent pathways and requires Bax〔J〕.Comp Neurol,2001;433(3)：299-311.

14中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会GB/T 21709.10-2008针灸技术操作规范 10部分穴位埋线〔S〕.北京：中国标准出版社，2008：1-7.

15关建军，贾成文，朱健康，等.针灸益气活血方对血管性痴呆大鼠海马T-chE活性表达的实验研究〔J〕.陕西中医学院学报，2008;31(6):65-6.

16关建军，姬军风，吴世卫，等.针灸益气活血方对血管性痴呆大鼠突触可塑性的实验研究〔J〕.陕西中医，2008;29(10):1416-7.

17姬军风，关建军，吴世卫.针灸益气活血法对血管性痴呆大鼠超氧化物歧化酶及丙二醛的影响〔J〕.河北中医，2011;33(10):1554-6.

〔2016-09-09修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

R743

A

1005-9202(2017)21-5236-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.008

贵州省教育厅自然科学研究项目(No.黔教科2010050)

1 贵阳中医学院解剖学教研室

唐中生(1977-)，男，硕士，教授，主要从事脑血管病学研究。

李 霞(1978-)，女，讲师，主要从事老年护理教育教学研究。