贵州西南喀斯特地区土壤芽孢杆菌资源及多样性研究

张 震，谢 和，张文杰，龙金花

(贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550000)

贵州西南喀斯特地区土壤芽孢杆菌资源及多样性研究

张 震，谢 和*，张文杰，龙金花

(贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550000)

采集兴义市坡岗、兴仁县清水河和安龙县青龙山三个贵州省西南部喀斯特保护区土样，利用平板分离方法分离芽孢杆菌，根据形态学观察、生理生化实验和16SrRNA基因序列分析对其进行鉴定。结果表明：从54份土样中共分离到芽孢杆菌129株，鉴定为24个种，分为3个属：芽孢杆菌属(Bacillus)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)和短芽孢杆菌属(Brevibacillus)，其中芽孢杆菌属为优势属(93.80%)，苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)(20.16%)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)(14.73%)和维德曼芽孢杆菌(Bacilluswiedmannii)(10.08%)为优势种。在多样性方面，清水河保护区的Margalef丰富度指数、Shannon-Wiener多样性指数和Pielou均匀度指数皆最高(3.937 7，2.445 5，0.903)，坡岗保护区的Shannon-Wiener多样性指数和Pielou均匀度指数最低(2.216 0，0.818 3)，青龙山保护区的Margalef丰富度指数最低(3.358 1)；从Jaccard相似性指数来看，坡岗与清水河、青龙山保护区的芽孢杆菌资源不相似(0.243 2，0.187 5)，而清水河与青龙山中等不相似(0.257 1)。

喀斯特地区；芽孢杆菌；资源；多样性

芽孢是生命世界中抗逆性最强的一种结构，能够抵抗高温、干燥、紫外线、电磁辐射和腐蚀性化学药品等极端因素的影响，广泛分布于自然界的各种生境中[1，2]。能够形成芽孢的细菌，包括芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、海洋芽孢杆菌属、梭菌属和脱硫肠状菌属、八叠球菌属等。芽孢杆菌因其独有的生理特征和理化性质，在工业、农业、医学、环保和军事领域具有重要的应用研究价值。

土壤作为微生物聚集的大本营，是调查微生物资源及多样性的重要场所。贵州省地处云贵高原，平均海拔1 100 m，拥有典型的喀斯特岩溶地貌。位于副热带东亚大陆的季风区内，属于中国亚热带高原季风湿润气候，大部分地区气候温和，年均气温14～16℃，年平均降水量1 100～1 300 mm，雨量充沛，相对湿度较大。土壤类型十分丰富，从亚热带的红壤到暖温带的棕壤均有分布，以黄壤为主。这些独特的地理、气候和土壤特点，使得该地区蕴含丰富的土壤芽孢杆菌资源。目前为止，关于贵州喀斯特地区芽孢杆菌资源及多样性的系统研究较少。鉴于此，本研究从采集贵州省喀斯特地区土壤样本入手，通过土壤芽孢杆菌分离鉴定和多样性分析，对贵州喀斯特地区芽孢杆菌资源和生态多样性展开调查研究。

1 材料与方法

1.1试验材料

1.1.1土壤样品 选取贵州省兴义市坡岗、兴仁县清水河、安龙县青龙山三个喀斯特保护区采样点(参见表1)，于保护区内不同海拔、不同生境下，采集地表以下5～10 cm的土壤，装入无菌密封袋，及时分离土壤芽孢杆菌。

表1 土壤样本采集地环境描述Tab.1 Environment description of soil samples from collection sites

1.1.2分离培养基 分离培养基为牛肉膏蛋白胨培养基[3]。

1.1.3试剂 芽孢杆菌基因组DNA提取采用BIOMIGA公司细菌基因组DNA提取试剂盒(GD2411 Bacterial gDNA Miniprep kit)。

1.2试验方法

1.2.1分离纯化 分离纯化方法参照《微生物学实验》[3]。

1.2.2芽孢杆菌的分类鉴定

1.2.2.1 形态学观察和生理生化实验 形态学观察和生理生化试验方法参照《微生物学实验手册》[4]与Bergey’sManual©ofSystematicBacteriology[5]。

1.2.2.2 16SrRNA基因序列测定 PCR扩增引物为细菌16SrRNA基因扩增通用引物63F(CAGGCCTAACACATGCAAGTC，5’→3’)和1387R(GGGCGGWGTGTACAAGGC，5’→3’)[6]。

PCR反应体系为25 μl体系(参见表2)，反应条件参见表3。

表2 25μl PCR反应体系Tab.2 PCR reaction system of 25μl

表3 PCR反应条件Tab.3 PCR reaction condition

PCR产物由上海英潍捷基生物技术有限公司进行测序，得到16SrRNA 基因序列。将序列于EzTaxon(www.ezbiocloud.net)进行比对，使用MEGA6.0软件构建各个保护区内分离所得芽孢杆菌的系统发育树。参数为：邻位相连法(Neighbor-joining)、Kimura2-Parameter Distance模型、重复取样自展值(Bootstrap)为1 000[7]。

1.2.3芽孢杆菌种类优势度分析 参数：所在群落的所有芽孢杆菌的个体数之和(N)、芽孢杆菌i的个体数(Ni)；分析公式：di=Ni/N=pi。芽孢杆菌占总物种的百分比di≥10%为优势种，1%

1.2.4芽孢杆菌群落多样性分析 参数：所在群落的所有芽孢杆菌的菌株数之和(N)、种类数目(S)、种群优势度(d)、Margalef丰富度指数(R)、香农-维纳(Shannon-Wiener) 的多样性指数(H’)、Pielou均匀度指数(J)和Jaccard相似性指数(Cj)；各分析指数的公式如下：

Margalef丰富度指数：R=(S-1)/lnN；

Shannon-Wiener多样性指数：H’=-∑dilndi(i=1，2，3，…，n)；[8]

Pielou均匀度指数：J=H’/lnS；[9]

Jaccard相似性指数：Cj=c/(a+b+c)。

式中a和b分别为两种生境地中芽孢杆菌的种数或属数，c为两种生境地中共有的芽孢杆菌种数或属数。Jaccard相似性指数(Cj)用于比较两个生境地中芽孢杆菌种类组成的相似程度，当0.00≤Cj<0.25时，表现为不相似；当0.25≤Cj<0.50时，表现为中等不相似；当0.50≤Cj<0.75时，表现为中等相似；当0.75≤Cj≤1时，表现为极相似。

2 结果与分析

2.1分离纯化结果

于三个喀斯特保护区共采集土样54份，分离到细菌189株，通过芽孢染色及观察，初步确定芽孢杆菌129株(68.25%)。

表4 芽孢杆菌形态和生理生化试验结果Tab.4 Physiological and biochemical test results of Bacillus-like species

注1：表格中“+”表示试验结果为阳性，“-”表示试验结果为阴性，“d”表示不同的菌株表现不同的试验结果，“w”表示阳性反应极其微弱；注2：Bacillushorneckiae尚未有对应的中文芽孢杆菌命名；注3：CM000739_s、JH792383_s和JH792233_s在菌种库中尚未有明确的芽孢杆菌命名。

2.2芽孢杆菌的分类鉴定结果

结合部分生理生化试验结果(参见表4)，根据16SrRNA基因序列分析，将129株芽孢杆菌鉴定为24个种，涉及3个属：分别为芽孢杆菌属(Bacillus)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)和短芽孢杆菌属(Brevibacillus)(参见表5)。

2.3各保护区芽孢杆菌分布概况及优势度分析

坡岗保护区内苏云金芽孢杆菌和短短芽孢杆菌属于优势种，并且短短芽孢杆菌为该地区特有菌种；该地区其他特有芽孢杆菌为暹罗芽孢杆菌、JH792233_s菌株、桥石短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌枯草亚种。

清水河保护区优势种为苏云金芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌；该地区特有芽孢杆菌为病研所芽孢杆菌、解木糖赖氨酸芽孢杆菌、路西法芽孢杆菌和郭霍氏杆菌。

青龙山保护区优势种是苏云金芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、维德曼芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌，其中蕈状芽孢杆菌为该地区特有菌种；该地区其他特有芽孢杆菌为单纯杆菌和弯曲芽孢杆菌。

三个保护区优势种为苏云金芽孢杆菌(20.16%)、蜡样芽孢杆菌(14.73%)和维德曼芽孢杆菌(10.08%)，芽孢杆菌属为优势属(93.80%)。以上结果可以体现出贵州西南喀斯特地区生境下一定的芽孢杆菌资源及分布特点。具体参见表5。

表5 芽孢杆菌资源种类及优势度结果Tab.5 Resources and dominance of Bacillus-like species

注1：“0.0000”表示该区域未分离到该种芽孢杆菌；注2：Bacillushorneckiae尚未有对应的中文芽孢杆菌命名；注3：CM000739_s、JH792383_s和JH792233_s在菌种库中尚未有明确的芽孢杆菌命名。

2.4各保护区芽孢杆菌群落多样性分析

从图1(A， B)得出，清水河保护区数值皆最高，青龙山保护区R值最低，坡岗保护区H’值最低。表明清水河保护区土壤芽孢杆菌在种类数量方面和种属水平分布均匀度方面都具有优势，群落稳定性更加明显[10]。

从图1(C)得出，清水河保护区J值最高，坡岗保护区J值最低。表明清水河保护区土壤芽孢杆菌在种属间和种内分布都比较均匀。

图1 各保护区相关指数结果Fig.1 Relevant index of any reserve

坡岗与清水河之间的相似性指数Cj为0.243 2，表现为不相似；坡岗与清水河之间的相似性指数Cj为0.187 5，表现为不相似；清水河与青龙山之间的相似性指数Cj为0.257 1，表现为中等不相似(参见表6)。

表6 各保护区间相似性指数结果Tab.6 Similarity index between any reserve

3 讨 论

土壤芽孢杆菌资源及多样性研究越来越受到专家学者的青睐。王子旋等对新疆不同地区的土壤芽孢杆菌种类及其多样性进行了调查， 结果显示新疆地区芽孢杆菌种类较丰富， 但在种类和数量上受空间分布影响[11]；刘国红等对玉米根际土壤的芽孢杆菌做了一定的研究，发现了芽孢杆菌与玉米根部之间的相关联系[12]；葛慈斌等首次调查了武夷山地衣表生和内生芽孢杆菌种类多样性，发现芽孢杆菌属为优势属，苏云金芽孢杆菌为优势种[13]。

在贵州西南部喀斯特地区土壤芽孢杆菌多样性方面，清水河保护区自然生境类型丰富，海拔地势低，气候湿润温热，人为活动影响小，参数相对较高；而坡岗保护区气候偏干燥，人为活动较频繁，参数相对较低。一定程度上反映出人为活动程度、湿度、海拔高度、生境种类、种群密度等环境因素会对土壤芽孢杆菌丰富度、多样性、分布均匀度等造成一定的影响，在人为活动程度小、湿度大、海拔低、生境类型丰富、种群密度适中的生境下，芽孢杆菌各种多样性指数相对更有优势。受人为活动因素影响较大的生境与自然生境在芽孢杆菌资源相似度方面有着较高的差异，自然生境间差异不显著。

苏云金芽孢杆菌是世界范围内应用最广泛的生防芽孢杆菌之一，在本次研究土壤中具有明显的优势度，同样，阿氏芽孢杆菌和短短芽孢杆菌也可应用于生防制剂的研发，可以为生防芽孢杆菌的开发和利用储备菌种，提升作物病虫害防治水平；高地芽孢杆菌因其具有脱氮除磷作用[14]，是一种良好的废水净化功能菌种，蕈状芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌等在污水处理的解磷、解氮和重金属离子吸附方面也有相关应用；维德曼芽孢杆菌是美国于2016年从乳制品分离出的一株新型耐冷、具有致病性的芽孢杆菌[15]，在喀斯特地区土壤中的报导尚属首次；菌种JH792383_s、菌种CM000739_s和菌种JH792233_s在菌种库中尚未有明确的芽孢杆菌命名，相关研究报导极少，具有较高的研究价值。

以上结果显示了该地区具有较丰富的土壤芽孢杆菌资源，并且其分布及多样性特征与当地生境之间存在一定的关联，可为研究贵州西南喀斯特地区芽孢杆菌特点提供相应的参考。

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ResearchonResourcesandDiversityaboutSoilBacillusofKarstAreaintheSouthwestofGuizhouProvince

ZHANGZhen，XIEHe*，ZHANGWen-jie，LONGJin-hua

(1.CollegeofLifeScience，GuizhouUniversity，Guiyang，Guizhou550000，China)

54 soil samples were collected from Pogang nature reserve in Xingyi city，Qingshui River nature reserve in Xingren county and Qinglong Mountain nature reserve in Anlong county in Karst landform area of southwest of Guizhou province.TheBacillus-like species were isolated by utilizing plate separation method and then identified using morphological observation，Physiological and biochemical experiments and 16SrRNA gene sequence analysis. Results showed that 129 strains isolated from these soil samples belonged to 24Bacillus-like species and 3 genus(Bacillus，LysinibacillusandBrevibacillus).The dominant bacteria forming spore areBacillusthuringiensis(20.16%)，Bacilluscereus(14.73%)，Bacilluswiedmannii(10.08%)of three reserves andBacillusis dominant genera(93.80%).Further research in terms of diversity indicated that every index ofBacillus-like in Qingshui River was the highest(3.9377，2.4455，0.9031)， but Pogang had the lowest level of what included Shannon-Wiener diversity index and Pielou evenness index (2.2160，0.8183)，and the Margalef richness index about Qinglong Mountain was the lowest (3.3581).Pogang was not similar to Qingshui River and Qinglong Mountain(0.2432，0.1875)， while Qingshui River and Qinglong Mountain were not either moderately concerning the Jaccard similarity index(0.2571).

Karst landform area；Bacillus；resources；diversity

2017-04-11；

2017-10-17

国家科技基础性工作专项，西南喀斯特地区特色微生物资源及多样性调查(编号：2014FY120100)。

*

谢 和，副教授，主要研究方向：微生物资源学。E-mail：xieheh@163.com。

Q938

A

1008-0457(2017)05-0036-06国际DOI编码10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.05.006