紫斑谷螟豹皮樟虫茶小鼠急性毒性和骨髓红细胞微核试验研究

王 芳，陈 松，刘仁普，杨茂发

(贵州大学昆虫研究所/贵州山地农业病虫害重点试验室，贵州 贵阳 550025)

紫斑谷螟豹皮樟虫茶小鼠急性毒性和骨髓红细胞微核试验研究

王 芳，陈 松，刘仁普，杨茂发*

(贵州大学昆虫研究所/贵州山地农业病虫害重点试验室，贵州 贵阳 550025)

用小鼠最大耐受量法、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠精子畸形试验等方法，究紫斑谷螟豹皮樟虫茶对小鼠的急性毒性和致突变性作用。结果显示，紫斑谷螟豹皮樟虫茶的小鼠急性经口LD50>30 g/kg·bw，小鼠骨髓红细胞微核试验结果为阴性。结果表明，紫斑谷螟豹皮樟虫茶属无毒物，对小鼠体细胞无致突变性。

急性毒性；微核试验；致突变作用；小鼠

虫茶被誉为“茶中奇珍”，是一种绝佳的医药保健饮品，由特定种类昆虫取食相应的特定寄主植物后所产排泄物精制而成[1-4]。据《本草纲目》记载，虫茶具有清热、解毒、健脾胃、祛暑、助消化等功效，对腹泻、鼻衄、牙龈出血和痔出血均有较好疗效，是热带和亚热带地区的一种重要的清凉饮料[4]。据报道[5～7]，我国民间用来生产虫茶的昆虫种类主要有7种：即米缟螟(Aglossadimidiata)、化香夜蛾(Hydrillodesmorosa)、白条谷螟(Fujimaciabicoloralis)、黄条谷螟(Herculiaglaucinalis)、弓须夜蛾(Hhdrillodesrepugnalis)、雪疽夜蛾(Nodarianiphona)、紫斑谷螟(Pyralisfarinalis)等。寄主植物包括三叶海棠(Malussieboldii)、化香树(Platycaryastrebilacea)、苦藤茶(Sageretiathea)、苦丁茶(Rubushenryi)和豹皮樟(Litseacoreana)等。其中取食三叶海棠、苦藤茶和苦丁茶的多是米缟螟、白条谷螟和黄条谷螟(灰直纹螟)，取食化香树叶的则是化香夜蛾、弓须夜蛾和雪疽夜蛾，取食豹皮樟的有米缟螟和紫斑谷螟。

不同昆虫种类取食同种寄主植物，或者同种昆虫取食不同的寄主植物所产的虫茶，其颗粒的大小、色泽会有所不同，营养成分、功效以及利用角度也有较大的差异[8]。紫斑谷螟(PyralisfarinalisLinnaeus)，属鳞翅目 (Lepidoptera)螟蛾科 (Pyralidae)螟蛾属(PyralisLinnaeus)，是贵州地区用以生产虫茶的主要昆虫种类之一[7]。紫斑谷螟幼虫取食豹皮樟(Litseacoreana)所产的排泄物经系列加工后即为紫斑谷螟-豹皮樟虫茶(下称“紫樟虫茶”，PLIT)。目前尚无针对紫斑谷螟豹皮樟虫茶安全性毒理学方面的研究报道。本文将选用急性毒性试验和小鼠骨髓微核试验研究其急性毒性和体内致突变性，以期为紫斑谷螟豹皮樟虫茶的安全性毒理学评价提供参考依据。

1 试验材料

1.1受试物

紫斑谷螟豹皮樟虫茶溶液制备：紫斑谷螟豹皮樟虫取自贵州大学昆虫研究所虫茶饲养室；将紫斑谷螟自初孵幼虫起便以贵州赤水樟樟科植物豹皮樟(Listseacoreana)叶进行饲养，收集到的虫茶经网筛去除杂质粉尘，再依次进行紫外线杀菌15 min，再经50℃恒温干燥箱烘至恒重备用。根据《受试物试验前处理方法(GB15193.21-2014)》[9]，获得的紫斑谷螟豹皮樟虫茶采用常压、温度80～90℃，十倍的蒸馏水的浸泡30 min提取，重复两次，合并浸泡液150目网筛滤除茶渣，将提取液减压浓缩、干燥至干粉状，室温储藏备用，每1 g浓缩干粉状样品相当于紫斑谷螟原来生药样品5 g的量。使用时，将浓缩后的受试物样品以80～90℃蒸馏水冲泡溶解制得饱和溶液，然后稀释至所需浓度。

1.2试剂

Giemsa染液：称取Giemsa 染料3.8 g，加入375 mL甲醇研磨，待完全溶解后，再加入125 mL 甘油。置37℃恒温箱保温48 h，期间摇荡数次，取出过滤，两周后可用。Giemsa 应用液：取一份Giemsa 染液与6份磷酸缓冲液混合而成，现用现配。环磷酰胺购于浙江天杭生物科技有限公司，含量97.0～103.0%(HPLC)，分子量279.10，规格1 g，批号302A037，CAS6055-19-2；新生胎牛血清购于浙江天杭生物科技有限公司，规格100 mL，批号20160328。

1.3仪器

解剖器械、生物显微镜、载玻片、注射器、计数器等。

1.4试验动物

根据《试验动物 环境及设施(GB 14925-2010)》[10]国家标准中相关规定，试验动物选用SPF级KM小鼠和SPF级SD大鼠，购自解放军第三军医大学试验动物中心，试验动物使用许可证号SCXK(渝)2012-2003。试验环境即饲养地点选择贵州大学贵州省生化工程中心SPF级动物试验室，动物饲养许可证号SYXK(黔)2013-00001。动物房为无菌隔离屏障环境，室内温度控制在23±2℃，湿度60±5%。

2 试验方法

2.1急性经口毒性试验

鉴于受试物特点，根据急性经口毒性试验国家标准(GB15193.3-2014)[11]本次试验采用限量法，测定皮樟虫茶对小鼠的急性毒性作用。试验选用20只体重在18～22 g的KM小鼠，雌雄各10只，雌雄分开饲养，每笼5只，用品红染色编号标记，试验前在SPF级动物饲养房观察适应5 d，试验期间自由饮水和食物。灌胃前禁食4 h，自由饮水，给予受试物后继续禁食1～2 h；采用30 g/kg·bw剂量一次性经口灌胃，灌胃后连续观察两周，参照标准记录小鼠各系统中毒指标，试验末期进行解剖检查，若大体解剖有异常病理改变则应做进一步的病理组织学观察。观察期每周记录体重一次。按照标准判定结果。

2.2小鼠骨髓红细胞微核试验

根据国家标准(GB15193.3-2014)[12]取SPF级健康KM小鼠50只，每组10只(雌雄各半)，体重在25～35 g，雌雄随机分笼饲养，每笼5只；小鼠随机分为5组，即按10、5和2.5 g/kg·bw灌服紫斑谷螟豹皮樟虫茶的高、中、低三个剂量组，腹腔注射环磷酰胺(40 mg/kg·bw)的阳性对照组，灌服等体积蒸馏水的阴性对照组。试验采用30 h灌胃法，即两次给予受试物，期间间隔24 h，末次给予后6 h采集骨髓1次，试验末期颈椎脱臼处死动物，取大腿股骨，参照国家标准制作小鼠骨髓涂片，经甲醇中固定，Giemsa和吖啶橙染色油镜镜检嗜多染红细胞，计数嗜多染红细胞(PCE)和正染红细胞(NCE)在总细胞中的比例，观察嗜多染红细胞，计数有微核(MNPCE)的嗜多染红细胞频率，以千分率表示。

2.5数据处理

试验数据用SPASS20.0软件进行处理，以Mean±S表示，急性经口毒性试验体重数据采用均值分析；红细胞骨髓细胞微核试验微核率和P/N比值采用双侧T检验[13]。

3 试验结果

3.1急性经口毒性试验

选用最大可使用剂量(30 g/kg·bw)给20只SPF级小鼠(雌雄各半)一次性经口灌胃后，14 d内未见小鼠死亡，说明紫斑谷螟豹皮樟虫茶对小鼠LD50大于30 g/kg·bw。试验期内小鼠瞳孔、皮肤、毛色、采食、饮水、粪便和行为等均未见异常；未观察到震颤、惊厥、流涎、呆滞、嗜睡、昏迷等异常状况；试验末期颈椎脱臼处死小鼠，大体解剖检查所见小鼠心、肝、脾、肺、胃和肾等主要内脏结构以及生殖系统未发现颜色、形态异常，未见血点或其他异常病变，故尸检未见异常。按照国标判断：紫斑谷螟豹皮樟虫茶在最大可使用剂量(30 g/kg·bw)下对小鼠未观察到有害作用。

3.2小鼠骨髓红细胞微核试验

本试验结果表明(表1)：阳性试验组的微核数和与阴性对照组相比较微核数、微核率和PCE/NCE值均差异极显著(P<0.01)，而紫斑谷螟豹皮樟虫茶受试物各剂量组与阴性对照组相比较微核数、微核率和PCE/NCE值均差异不显著(P>0.05)。

表1 PLIT对雄性小鼠骨髓红细胞微核的影响(mean±s)Tab.1 Effect of PLIT on bone narrow cell micronucleus of male mice

注：CP：环磷酰胺；“*”表示与阴性对照组相比差异显著(P<0.05)；“**”表示与阴性对照组相比差异极显著(P<0.01)。

根据国家标准评价，在本试验条件下，紫斑谷螟豹皮樟虫茶受试物不引起哺乳动物嗜多染红细胞含微核细胞率增加。

4 讨 论

急性毒性是指机体次接触或内多次接触化学物质后在短期最长到内所发生的毒性效应，包括一般行为、外观改变、大体形态变化以及死亡效应。是检测和评价受试物毒性作用最基本的一项试验，即经口一次性或24 h内多次给予受试物后，在短期内观察动物所产生的毒性反应，包括中毒体征和死亡体征，通常用LD50来表示。急性毒性试验是毒理研究的主要内容之一，目的是测试和求出化学毒物对一种或几种试验动物的致死量以表示以及其他的急性毒性参数，了解急性毒作用的强度。并通过观察动物中毒表现和死亡的情况，了解急性毒作用性质、可能的靶器官和致死原因，提供化学毒物的急性中毒资料。初步评价对人体产生损害的危险性，探求化学毒物急性毒性的剂量一反应关系，为进一步毒理学试验的剂量设计和观察指标的选择提供参考依据，还可作为化学毒物分级和标签管理的基础。本次试验结果证明紫斑谷螟豹皮樟虫茶LD50远大于30 g/kg·bw，试验过程中未出现死亡现象，即未观察到有害作用剂量(NOVEL)为30 g/kg·bw，按照急性毒性分级标准属于实际无毒级别。

微核(Micronucleus)，是在细胞的有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍然滞留在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝点断片，或因纺锤体受损而丢失的整条染色体，它在末期以后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的胞质内而形成，比主核小，大约为主核的1/5～1/20，故称为微核。微核试验简单、经济、快速，是国际公认的致突变首选方法[13]。本次试验结果证明紫斑谷螟豹皮樟虫茶受试物对小鼠没有明显致突变作用。这与之前所报道的贵州白茶[14]、三叶虫茶[15-17]等研究结果相一致。但对于新食品资源的安全性确定还需要更多、更全面、多次重复反复的科学研究和更多的数据结果并且在充分考虑多种因素、生物学意义、不同人群群体差异等等多种情况下才能获得较准确的判断和评价[18]。

[1] 杨立昌，乙 引. 贵州白虫茶生物安全毒性理学评价研究[J]. 安徽农业科学，2010，38(15)：7826-7828.

[2] Xu L， Pan H， Lei Q，etal. Insect tea， a wonderful work in the Chinese tea culture[J].FoodResearchInternational， 2013， 53(2)： 629-635.

[3] 高 闽. 茶中奇珍-虫茶[J]. 商品知识，1999：34.

[4] 李时珍. 本草纲目(下册)[M]. 北京：人民卫生出版社， 1982.

[5] 刘健锋，杨茂发，胡吉凤，等. 贵州虫茶资源及其利用的现状调查[J]. 贵州农业科学，2015，43(2)：62-65.

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[10] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会. GB 1925-2010试验动物环境及设施[S].

[11] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会. GB 15193.3-2014急性经口毒性试验[S].

[12] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会. GB 15193.5-2014哺乳动物红细胞微核试验[S].

[13] 张均田， 杜冠华， 现代药理试验方法(下册)[M]. 北京：中国协和医科大学出版社， 2012：2221-2234.

[14] 杨立昌， 乙 引. 贵州白虫茶生物安全性毒理学评价研究[J]. 安徽农业科学， 2010(15)： 7826-7828.

[15] 易定宏， 文礼章， 杨中侠，等. 三叶虫茶对大鼠一般毒性试验[J]. 毒理学杂志， 2007(05)： 430-431.

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[17] 文礼章， 沈佐锐， 藏雪冰，等. 三叶虫茶的安全性毒理学评价[J]. 中国食品学报， 2004(02)： 86-90.

[18] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会. GB 15193.1-2014食品安全毒理学评价程序[S].

AcuteToxicityTestandMicronucleusTestofPyralisFarinalis-LitseaCoreanaInsectTeainMice

WANGFang，CHENSong，LIURen-pu，YANGMao-fa*

(InstituteofEntomology，GuizhouKeyLaboratoryforPlantPestsManagementofMountainousRegion，GuizhouUniversity，Guiyang，Guizhou550025，China)

The acute toxicity and mutagenicity ofPyralisfarinalis-LitseacoreanaInsect Tea in mice were investigated. Acute toxicity test， bone marrow polychromatic erythrocyte micronucleus test in mice were adopted. The results showed that the acute oral maximum LD50was higher than 30 g/kg·bw； the micronucleus test indicated that the difference between treating group and negative control group was not remarkable. The results proved that thePyralisfarinalis-LitseacoreanaInsect Tea is belongs to practical actox-ic and could not cause mutagenesis.

acute toxicity test； bone-marrow micronucleus test； mutation； mice

2017-05-09；

2017-09-16

国家自然科学基金项目“贵州主要虫茶昆虫生物学生态学及所产虫茶评价研究”(31260526)。

*

杨茂发(1968-)，男，教授，博士生导师，主要研究方向：昆虫及螨类系统学、害虫综合治理以及资源昆虫学；E-mail： gdgdly@126.com。

Q291

A

1008-0457(2017)05-0058-04国际DOI编码10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.05.010