131例强直性脊柱炎患者Treg细胞与淋巴细胞亚群分析

魏云玉　韩志君　黄红宇

[摘要] 目的 觀察强直性脊柱炎（AS）患者外周血Treg细胞与淋巴细胞各亚群的变化及HLA-B27的表达，探讨各自在AS患者发展中的作用。 方法 应用流式细胞学方法，选取2013年2月～2016年12月于无锡市第二人民医院骨科和风湿科就诊的AS患者131例为AS组，选取健康体检者127例为正常对照组，进行外周血Treg细胞、淋巴细胞亚群、HLA-B27的检测，分析Treg细胞、淋巴细胞亚群、HLA-B27与AS患者的关系。 结果 131例AS组中HLA-B27检测阳性为123例（93.89%），正常对照组中HLA-B27检测阳性为2例（1.57%），差异有统计学意义（P < 0.05）。AS组患者CD3+CD4+、CD4/CD8、CD3-CD19+阳性率明显高于正常对照组（P < 0.05），CD3+CD8+、CD16+/CD56+阳性率低于正常对照组（P < 0.05）。AS组患者CD4+CD25high、CD4+CD25highCD127low阳性率均低于正常对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。两组CD3+、CD3+CD4+阳性率比较差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 HLA-B27与AS有强相关性。外周血中淋巴细胞各亚群组分在AS与正常对照组中存在明显差异。同时外周血中Treg细胞在AS患者中明显降低。以上发现提示细胞免疫和体液免疫可能在AS中发挥重要作用。

[关键词] 强直性脊柱炎；Treg细胞；淋巴细胞亚群；HLA-B27

[中图分类号] R681.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）10（a）-0046-03

[Abstract] Objective To analyze the changes of regulatory T cells （Treg cells） and the subsets of lymphocytes as well as the HLA-B27 expression in peripheral blood of ankylosing spondylitis （AS） patients， and then explore their roles in the development of AS. Methods Flow cytometry was applied. From February 2013 to December 2016， Department of Orthopedic and Rheumatology in Wuxi Second People's Hospital， 131 cases of AS patients were selected as AS group， 127 healthy subjects were selected as normal control group. The peripheral blood Treg cells， lymphocyte subsets and HLA-B27 were detected. The relationship of Treg cells， lymphocyte subsets， HLA-B27 and AS patients were analyzed. Results 131 cases of AS group， HLA-B27 positive for 123 cases （93.89%）， the positive rate of HLA-B27 in normal control group was 2 cases （1.57%）， the difference was statistically significant （P < 0.05）. The positive rate of CD3+CD4+， CD4/CD8 and CD3-CD19+ in AS group were significantly higher than those in normal control group （P < 0.05）. The positive rate of CD3+CD8+， CD16+/CD56+ in AS group were lower than those in normal control group （P < 0.05）. The positive rate of CD4+CD25high and CD4+CD25highCD127low in AS group were lower than those in normal control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. There was no significant difference in the positive rate of CD3+ and CD3+CD4+ between two groups （P > 0.05）. Conclusion HLA-B27 has a strong correlation with AS. There are significant differences in the subgroups of lymphocytes in peripheral blood between AS and normal control group. At the same time， peripheral blood Treg cells in AS patients are significantly reduced. The above findings suggest that cellular immunity and humoral immunity may play an important role in AS.endprint

[Key words] Ankylosing spondylitis； Regulatory T cells； Lymphocyte subsets； HLA-B27

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一种全身免疫疾病，以慢性炎症为主，它可侵犯脊柱关节，累及肌腱、滑膜等关节，大部分患者有骶髂关节炎。AS青壮年多发，有家族聚集性，可能与遗传相关。其发病机制复杂，迄今未明[1]。Treg细胞是有免疫调节作用的特殊的一群淋巴细胞。在维持免疫自稳中起重要作用。AS患者是一种全身性免疫疾病，本研究主要观察其与外周血淋巴细胞和Treg细胞比例变化的关系，探讨淋巴细胞及其各组分失衡对AS发生、发展的影响，有可能为AS的发病机制研究及治疗提供一条思路。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2013年2月～2016年12月于无锡市第二人民医院骨科和风湿科门诊或住院的AS患者131例为AS组，患者诊断均符合1984年的AS纽约标准[2]，其中男75例，女56例，年龄18～65岁，平均（27±8）岁，病程3～8年，平均（5.3±2.7）年，收集了AS患者基本情况和临床资料，HLA-B27阳性患者128例，阴性患者3例。患者活动度评价，采用2009年由国际脊柱关节炎协会（ASAS）重新制订的新的AS病情活动度评分（ASDAS）[3]。正常对照组选取健康体检者127例，男70例，女57例，平均年龄（26±9）岁。均不符合1984年的AS诊断标准，无重大疾病史，没有长期应用激素或免疫抑制剂，咨询受检者，本人或直系亲属未患自身免疫性疾病。

1.2 主要仪器和试剂

CYTOMICS FC500流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司），荧光抗体CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5，Anti-HLA-B27-FITC/Anti-HLA-B7-PE，CD4-FITC，CD25-PECY5，CD127-PE，购于Beckman Coulter公司，CD3-FITC/CD16+56-PE，CD19-PE，购于美国BD公司。

1.3 方法

1.3.1 血液样本准备 所有AS患者和正常对照组人员于早晨7：30～8：30之间空腹抽取2 mL静脉于EDTA抗凝管中。2 h内用于流式细胞仪的分析。

1.3.2 流式细胞分析HLA-B27、淋巴细胞亚群、Treg细胞 将每个标本分成5管：HLA-B27/HLA-B7管、CD4/CD8/CD3管、CD4/CD25/CD127管、CD3/CD16+56管和CD19管。分别加入各自抗体20 μL，每管加入100 μL EDTA抗凝全血，避光孵育20 min，PBS洗涤2次后上机检测。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HLA-B27检测

131例AS组中HLA-B27检测阳性为123例（93.89%），正常对照组中HLA-B27检测阳性为2例（1.57%），差异有统计学意义（P < 0.05）。我国AS患者中HLA-B27阳性率达90%[4]。

2.2 淋巴细胞亚群检测

AS组患者CD3+CD4+、CD4/CD8、CD3-CD19+阳性率明显高于正常对照组（P < 0.05），CD3+CD8+、CD16+/CD56+阳性率低于正常对照组（P < 0.05）；两组CD3+阳性率比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.3 Treg细胞检测

AS组患者CD4+CD25high、CD4+CD25highCD127low阳性率均低于正常对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；两组CD3+CD4+阳性率比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

3 讨论

AS是具有遗传性的慢性自身免疫疾病，可伴有血液系统、肺部、心脏、神经系统等关节外病变损害[5]。其发病率在我国约为0.3%[6-7]。HLA-B27与AS有强相关性，其直接参与了AS的发病。本研究结果AS患者HLA-B27阳性率达到93.89%，正常人也有一部分阳性，但比例比较小。HLA-B27高表达的同时，可能其他免疫分子也发生了变化，一般的表现为免疫功能非正常的亢进，形成多关节的炎性反应[8]。

在AS的发生、发展过程中还与很多因素有关，免疫功能的紊乱、炎症细胞浸润、遗传因素、环境因素、细胞因子的作用等都有可能对其发挥作用[9-12]。淋巴细胞亚群和Treg细胞数量的变化和功能上的失衡与多种免疫疾病有关[13-14]。我们的研究发现，AS患者的淋巴细胞有多项亚群以及Treg细胞与正常对照差异有显著性。表明AS患者体内存在免疫功能的失衡。Treg细胞在数量或功能上的减少导致免疫稳定的破坏，使AS患者发病。这可能是一个重要原因。

本文的數据显示，CD3+CD4+T细胞升高，CD3+CD8+T细胞降低，CD4/CD8比值升高，CD3-CD19+B细胞升高，提示AS患者细胞免疫功能亢进，体液免疫可能也增强了，CD16+/CD56+NK细胞功能下降。有研究表明[15-16]，AS患者的B淋巴细胞活动性增强，增加的B淋巴细胞分泌大量的免疫球蛋白，使血清中免疫球蛋白显著增加，自身抗体也增多[17-21]，临床上出现一系列的免疫功能紊乱的症状。NK细胞功能下降使抑制B细胞的分化增殖功能下降，体液免疫功能进一步增强，疾病加重。Park等[22]研究表明，系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等自身免疫病患者外周血NK细胞减少、功能受损。本文研究发现，AS患者NK细胞也下降，不能有效调节自身免疫。另外，Treg细胞也可以反向调节T淋巴细胞的活性与抑制其增殖，Treg细胞通过直接接触、释放细胞因子、颗粒酶等杀伤T细胞、单核细胞、B细胞。endprint

基于以上讨论，免疫功能的紊乱在AS的发病过程中起一定的作用，淋巴细胞亚群、Treg细胞的检测可作为AS的重要诊断指标。适当提高Treg细胞水平和降低B细胞活性，可能对AS患者的治疗有重要的意义，这给临床对AS的治疗提供了新的思路。

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（收稿日期：2017-06-06 本文编辑：李亚聪）endprint