降香新黄酮latifolin对大鼠急性心肌缺血影响及介导Nrf2信号通路机制研究

李雪亮　陈兰英　官紫祎　骆瑶　崔亚茹　刘荣华　邵峰　王定清

[摘要]研究降香新黃酮latifolin对垂体后叶素（Pit）及异丙肾上腺素（ISO）致大鼠急性心肌缺血保护作用及作用机制。Pit及ISO分别诱导大鼠急性心肌缺血，观察大鼠心电图变化。ISO诱导大鼠急性心肌缺血，ELISA法或比色法检测血清中心肌损伤标志物含量或活力、比色法检测心肌中SOD活力及MDA含量；HE染色进行组织病理学检查；心肌组织冰冻切片进行DCFHDA荧光染色，检测心肌中ROS含量水平；Western blot法检测心肌中Nrf2，Keap1，HO1及NQO1的蛋白表达水平。心电图结果显示，latifolin抑制Pit及ISO引起的ST段变化，抑制Pit引起心率减慢。机制研究结果显示，latifolin降低血清中cTnI含量和AST及LDH活力；升高心肌中SOD活力，降低心肌中MDA含量；降低心肌组织炎细胞浸润、肌纤维断裂及坏死的程度；减弱心肌DCFHDA荧光染色的荧光强度；抑制Keap1的蛋白表达，促进Nrf2核转移，促进HO1及NQO1的蛋白表达。结果表明降香新黄酮latifolin对大鼠急性心肌缺血具有保护作用，主要机制可能与激活Nrf2信号通路从而发挥抗氧化作用有关。

[关键词]latifolin； 垂体后叶素； 异丙肾上腺素； 心肌缺血； Nrf2信号通路

[Abstract]The present study was designed to evaluate the cardioprotective effect of latifolin on pituitrin（Pit） or isoproterenol（ISO）induced myocardial injury in rats， and further investigate its underlying mechanisms Rats were administrated sublingually with pituitrin or subcutaneously with isoproterenol to induce acute myocardial ischemia in rats， and lead II electrocardiograph was recorded In rats with isoproterenol， ELISA assay or colorimetric method was used to detect the content or activity of myocardial injury markers in serum， and the SOD activity and MDA content in myocardium were detected by colorimetric assay； histopathological examination was conducted by HE staining； the frozen section of myocardial tissues was used for DCFHDA fluorescent staining to detect the content of ROS in myocardium； Western blot was used to detect the protein expression levels of Nrf2， Keap1， HO1 and NQO1 in myocardium Results showed that latifolin significantly inhibited STsegment changes induced by pituitrin or isoproterenol， and increased heart rate Further mechanism study showed that latifolin reduced cardiac troponin I（cTnI） level， aspartate transaminase（AST） and lactate dehydrogenase（LDH） activities in serum， increased myocardial superoxide dismutase（SOD） activity and reduced myocardial malondialdehyde（MDA） level， and protected myocardium with less necrosis， infiltration of inflammatory cells and fracture of myocardial fibers Furthermore， latifolin obviously reduced ROS level in myocardium， inhibited the expression of Kelchlike ECHassociated protein1（Keap1）， increased the nuclear translocation of nuclear factor erythroid 2 related factor 2（Nrf2）， and promoted the expression of Heme oxygenase1（HO1） and NAD（P）H quinone oxidoreductase1 （NQO1） in myocardial tissues Our data suggest that latifolin has a potent protective effect against pituitrin or isoproterenolinduced myocardial injury， which may be related to inhibition of oxidative stress by activating Nrf2 signaling pathway.endprint

[Key words]latifolin； pituitrin； isoproterenol； myocardial injury； reactive oxygen species； Nrf2 signaling pathway

缺血性心脏病是引起人类死亡的主要因素，世界卫生组织公布的数据显示，2015年缺血性心脏病死亡人数占全球死亡人数的155%，对人类健康有着极其重大的威胁。药物治疗是目前缺血性心脏病的首选治疗方法，因此研发安全、有效、毒副作用小的治疗药物对缺血性心脏病的防治具有重要意义。降香为豆科植物降香檀Dalbergia odorifera T Chen树干和根的干燥心材，可化瘀止血，理气止痛，被广泛用于治疗胸痹刺痛和跌扑伤痛等[1]。舒心宁片、冠心丹参胶囊、血栓通、冠心Ⅱ号及通心络等含降香的中成药被广泛用于缺血性心脏病的治疗。降香主要包含挥发油和黄酮类化合物，药理学研究表明这些成分具有抗血栓、抗炎及抗氧化等生物活性[2]。课题组前期研究证实降香具有明显的抗心肌缺血作用，本课题主要开展降香有效成分latifolin對心肌缺血的保护作用及机制研究。

1材料

11动物

SPF级SD大鼠，雄性，体质量180～200 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号SCXK（湘）20110003。

12药品及试剂

latifolin[化学结构名称为（-）（R）latifolin，PubChem编号为340211]由江西中医药大学药学院提供，纯度>98%；硝酸异山梨酯片购自山西云鹏制药有限公司（批号B141001）；盐酸普萘洛尔片购自江苏亚邦爱普森药业有限公司（批号1505109）；垂体后叶素注射液购自南京新百药业有限公司（批号150104）；异丙肾上腺素（批号WXBB7695V）及DCFHDA（批号015M4038V）购自Sigma公司；AST试剂盒（批号20160311）、LDH试剂盒（批号20160311）、SOD试剂盒（批号20160311）、MDA试剂盒（批号20160309）均购自南京建成生物工程研究所；cTnI酶联免疫吸附试剂盒购自武汉优尔生商贸有限公司（批号L160303092）；胞浆/胞核蛋白提取试剂盒购自凯基生物科技发展有限公司（批号20160113）；兔Nrf2多克隆抗体（批号GR2499535）、兔Keap1多克隆抗体（批号GR2851673）、兔HO1单克隆抗体（批号GR9679510）、兔NQO1单克隆抗体（批号GR1950438）均购自Abcam公司；兔H3多克隆抗体（批号20）及兔βactin多克隆抗体（批号0007）购自Cell Signaling公司。

13仪器

ML866型Powerlab电生理记录仪（澳大利亚ADI Instruments）；SpectraMaxi3型多功能酶标仪（美国Molecular Devices）；5810R型冷冻离心机（德国Eppendorf）；COVER015型光学显微镜（日本OLYMPUS）；CM1850型冰冻切片机（德国LEICA）；DMI300B型荧光倒置显微镜（德国LEICA）；Western blot系统（美国BioRad）；BioRad凝胶成像系统（美国BioRad）。

2方法

21latifolin对急性心肌缺血大鼠心电图的影响

211latifolin对Pit致急性心肌缺血大鼠心电图的影响分组、给药及造模：SD大鼠随机分为正常组、模型组、硝酸异山梨酯片组（3 mg·kg-1）及latifolin高、中、低剂量组（100，50，25 mg·kg-1），正常组及模型组给予等体积的05%CMCNa溶液，连续灌胃给药5 d。末次给药后1 h，除正常组外，各组舌下静脉恒速推注Pit（1 U·kg-1），复制大鼠急性心肌缺血模型。正常组则按相同方法注射等体积的生理盐水。

心电图检测：腹腔注射20%乌拉坦麻醉大鼠，仰卧位固定于鼠板上，Powerlab电生理记录仪记录Ⅱ导联心电图。记录各组大鼠造模前后的心率和ST段高度（其中ST段无论抬高或压低，均以造模前后变化的绝对值进行统计学分析）。

212latifolin对ISO致急性心肌缺血大鼠心电图的影响分组、给药及造模：SD大鼠随机分为正常组、模型组、普萘洛尔组（30 mg·kg-1）及latifolin高、中、低剂量组（100，50，25 mg·kg-1），正常组及模型组给予等体积的05%CMCNa溶液，连续灌胃给药5 d。除正常组外，各组分别于给药第4天和第5天皮下注射ISO（30 mg·kg-1），复制大鼠急性心肌缺血模型。正常组则皮下注射等量的生理盐水，2次皮下注射间隔24 h。

心电图检查：末次给药45 min后，腹腔注射20%乌拉坦麻醉大鼠，仰卧位固定于鼠板上，Powerlab电生理记录仪记录Ⅱ导联心电图。记录各组大鼠造模前后的ST段高度（ST段无论抬高或压低，均以造模前后变化的绝对值进行统计学分析）。

22latifolin对ISO致急性心肌缺血大鼠保护作用机制研究

221分组、给药及造模方法同212项。

222血清心肌损伤标志物测定记录完心电图后腹主动脉取血，室温静置1 h后3 500 r·min-1离心15 min，分离血清。采用ELISA法测定血清cTnI含量，比色法测定血清AST，LDH活力。

223心肌匀浆SOD活力和MDA含量测定腹主动脉取血后，立即取出心脏。称取适量心室组织，制备10%心肌匀浆。采用比色法测定心肌匀浆中SOD活力及MDA含量。

224组织病理学检查大鼠心尖组织放入10%中性缓冲福尔马林溶液中固定，用于心肌组织HE染色。对心肌组织进行脱水、包埋、切片、染色及封片等操作，并在光学显微镜下观察及拍照。endprint

225心肌ROS含量测定大鼠心尖组织进行冰冻切片，厚度10 μm。切片上滴加25 μmol·L-1的DCFHDA溶液，于37 ℃保湿盒中避光孵育20 min。PBS冲洗2遍后滴加2 mg·L-1的 DAPI溶液，暗室中常温孵育20 min。PBS冲洗2遍后，将切片置于荧光倒置显微镜下进行荧光激发，观察切片荧光强度及拍照，并采用ImagePro Plus图像分析软件分析荧光强度。

226Western blot心尖组织称重后，按凯基胞浆/胞核蛋白提取试剂盒方法分别提取胞浆蛋白及胞核蛋白，胞浆蛋白用于胞浆Nrf2，Keap1，HO1及NQO1蛋白表达的测定，胞核蛋白用于胞核Nrf2蛋白表达的测定。BCA法测定各组蛋白样品的蛋白浓度并调至等蛋白浓度，沸水中煮5 min。蛋白样品进行SDSPAGE电泳，转膜，封闭，孵一抗（Nrf2抗体1∶1 200稀释；HO1抗体1∶15 000稀释；NQO1抗体1∶2万稀释；Keap1抗体1∶1 000稀释；βactin抗体1∶1 000稀释；H3抗体1∶1 000稀释）4 ℃过夜，孵辣根过氧化物酶标记二抗（1∶8 000稀释）室温15 h，凝胶成像儀中显色并进行半定量分析。

23统计学分析

采用SPSS 20统计软件进行分析，数据以±s表示，采用t检验（正常组与模型组）或ANOVA单因素方差分析，组间比较方差齐时采用LSD法，方差不齐时采用Dunnett T3法，P<005表示差异有统计学意义。

3结果

31latifolin对急性心肌缺血大鼠心电图的影响

311latifolin对Pit致急性心肌缺血大鼠心电图的影响正常大鼠注射Pit后5～20 s会出现T波升高、ST段抬高，30 s至数分钟则会出现T波低平、倒置、双向，心率减慢等[3]。本实验过程中发现，造模后0～15 min模型组ST段表现为先抬高后压低随后逐渐恢复至正常，其中在30 s时ST段出现明显压低，且与正常组比较，此刻ST段变化值显著升高（P<001）；另外造模后模型组心率显著降低（P<001）并伴有心律失常，表明造模成功。与模型组比较，latifolin各剂量组及硝酸异山梨酯片组ST段变化值显著降低（P<001，P<005）；latifolin中剂量组心率显著升高，latifolin高、低剂量组及硝酸异山梨酯片组心率具有升高的趋势，见图1。

312latifolin对ISO致急性心肌缺血大鼠心电图的影响与正常组比较，皮下注射ISO后，模型组心电图出现坏死性Q波，且ST段变化值显著升高（P<001），表明造模成功。与模型组比较，latifolin各剂量组及普萘洛尔组心电图出现坏死性Q波的动物数减少，且ST段变化值显著降低（P<001，P<005），见图2。

32latifolin对ISO致急性心肌缺血大鼠保护作用机制研究

321latifolin对血清心肌损伤标志物的影响与正常组比较，模型组血清中AST，LDH活力及cTnI

与正常组比较1）P<005，2）P<001；与模型组比较3）P<005，4）P<001（图2～7同）。

含量显著升高（P<001）。与模型组比较，latifolin高、中剂量组及普萘洛尔组血清中AST与LDH活力及血清中cTnI含量均显著降低（P<001，P<005）；latifolin低剂量组血清中LDH活力也显著降低（P<005），血清中AST活力及血清中cTnI含量也有降低的趋势，见图3。

322latifolin对心肌匀浆SOD活力及MDA含量的影响与正常组比较，模型组心肌中SOD活力显著降低（P<001），MDA含量显著升高（P<001）。与模型组比较，latifolin各剂量组及普萘洛尔组心肌中SOD活力显著升高（P<005）；latifolin各剂量组心肌中MDA含量显著降低（P<005），而普萘洛尔组心肌中MDA含量的变化不显著，见图4。

323latifolin对心肌组织病理变化的影响HE染色结果显示正常组心肌细胞结构清楚，未出现炎细胞浸润及坏死等病理学变化。模型组心肌细胞则出现坏死和炎细胞浸润，且这些病理变化在心内膜或乳头肌中更加明显。与模型组比较，latifolin各剂量组及普萘洛尔组心肌细胞出现坏死、肌纤维断裂及炎细胞浸润的程度明显减轻，见图5。

324latifolin对心肌组织中ROS的影响为了验证大剂量的ISO是否产生大量的ROS，本实验采用荧光探针DCFHDA来检测心肌中ROS的含量水平。荧光染色结果显示，正常组绿色荧光微弱；与正常组比较，模型组绿色荧光强度明显增加，表明大剂量ISO可以引起心肌组织中ROS的大量生成。与模型组比较，latifolin各剂量组及普萘洛尔组绿色荧光强度明显减弱。结果表明latifolin可减少ISO引

起的ROS生成，见图6。

325latifolin对Nrf2，HO1，NQO1及Keap1蛋白表达的影响为了研究latifolin发挥心肌保护作用的分子机制，本实验应用Western blot法来检测Nrf2/ARE通路相关蛋白表达水平。Western blot结果显示，与正常组比较，模型组胞浆Nrf2的蛋白表达无明显变化，胞核Nrf2，Keap1，HO1及NQO1的蛋白表达均显著升高（P<001，P<005）。与模型

组比较，latifolin各剂量组及普萘洛尔组胞浆Nrf2的蛋白表达无显著变化；latifolin高剂量组胞核Nrf2蛋白表达显著升高（P<001），中、低剂量组胞核Nrf2蛋白表达的变化不显著，而普萘洛尔组胞核Nrf2蛋白表达无明显变化；latifolin高剂量组HO1及NQO1的蛋白表达显著升高（P<005），中、低剂量组HO1及NQO1蛋白表达的变化不显著，而普萘洛尔组HO1的蛋白表达无明显变化但NQO1的蛋白表达具有升高的趋势；latifolin高剂量组和普萘洛尔组Keap1的蛋白表达显著降低（P<001，P<005），中、低剂量组Keap1蛋白表达的变化不显著。结果表明，latifolin可激活Nrf2/ARE通路，促进下游抗氧化基因的蛋白表达从而发挥心肌保护作用，见图7。endprint

4讨论

降香作为一味传统中药，常与其他中药配伍用于治疗心脑血管疾病。前期研究发现，latifolin为降香主要活性成分之一，在体外具有明显的心肌保护作用。进一步量效关系研究表明，latifolin中剂量（50 mg·kg-1）为体内心肌缺血保护作用的最佳剂量。本实验在前期研究基础上进一步验证latifolin的心肌保护作用，并对其发挥心肌保护作用的分子机制做初步探索。

Pit及ISO是复制急性心肌缺血动物模型常用的造模药物。Pit主要通过引起冠状动脉痉挛来诱发心肌缺血损伤，可模拟临床上变异型心绞痛的发病过程[4]，所得模型广泛用于抗心肌缺血药物的筛选。ISO为一种非选择性β受体激动剂，大剂量可导致心肌损伤，其引起的心电图、心肌代谢及组织病理学改变与人类急性心肌梗死相似[5]。心电图是一种辅助诊断心肌缺血和心肌梗死的重要技术手段。ST段作为心电图的一个重要参数，其抬高或压低可反映心肌细胞膜的完整性[6]。静息电位主要通过钾离子外流引起，钾离子外流是由细胞内外浓度差推动。Pit及ISO引起心肌细胞膜受损，导致大量钾离子内外流，引起缺血心肌极化程度不足或过度极化，与周围的正常心肌形成“损伤电流”，在心电图中表现为ST段抬高或者压低。本实验结果显示，latifolin可显著抑制Pit及ISO引起ST段抬高或压低，表明latifolin可保护心肌细胞膜，对急性心肌缺血大鼠具有保护作用。基于latifolin对Pit及ISO诱导的大鼠急性心肌缺血模型心电图的影响，进一步展开latifolin对ISO致大鼠急性心肌缺血模型保护作用的机制研究。

研究表明ISO引起的心肌损伤与细胞膜通透性改变有关，细胞膜通透性增加可引起细胞内心肌损伤标志物（如AST，LDH及cTnI等）释放入血。其中，AST，LDH为常见心肌酶，cTnI则为特异性存在于心肌内的小分子蛋白质，当心肌损伤时，心肌中的AST，LDH，cTnI会释放至血清中，从而引起血清中AST，LDH，cTnI的活力或含量升高。本实验结果显示，模型组血清中AST，LDH活力及cTnI含量显著升高，表明大剂量ISO可引起细胞膜通透性改变，导致心肌损伤标志物释放入血清。latifolin可降低血清中AST，LDH活力及cTnI含量，同时组织病理学检查显示latifolin可减轻ISO引起的心肌坏死、炎细胞浸润等病理学变化。上述实验结果进一步表明，latifolin可保护心肌细胞膜，减轻ISO引起的心肌损伤。

超氧化物歧化酶（SOD）是活性氧清除剂，能将体内超氧阴离子转化为过氧化氢，过氧化氢再经过其他酶作用转化为水。实验结果显示，latifolin升高心肌中SOD活力，表明latifolin可提高体内抗氧化能力。此外，MDA为脂质过氧化反应的重要产物，可反映细胞膜脂质过氧化反应的程度。实验结果显示，latifolin降低心肌中MDA含量，表明latifolin可降低细胞膜发生脂质过氧化反应的程度。上述实验结果表明，latifolin可提高机体抗氧化能力，降低细胞膜发生脂质过氧化反应的程度，从而发挥心肌保护作用。

研究表明，儿茶酚胺类物质（包括ISO）的氧化产物是引起心肌损伤的重要原因[7]。这些氧化产物可促进ROS的大量生成，进一步诱导细胞膜上的磷脂发生脂质过氧化反应，导致心肌细胞膜结构和功能的改变。为了验证过量的ISO是否在体内产生大量ROS，本实验应用DCFHDA对心肌组织的冰冻切片进行荧光染色。DCFHDA能自由通过细胞膜并被胞内脂酶水解成DCFH，DCFH不能穿过细胞膜并被胞内的ROS氧化生成具有绿色荧光的DCF，根据DCF的荧光强度可评估心肌细胞中ROS的含量水平。荧光染色结果显示，latifolin明显减弱心肌荧光强度，表明latifolin可清除ISO诱导生成的ROS。

Nrf2是重要的核转录因子，Nrf2/ARE通路在体内发挥重要的抗氧化作用[8]。正常条件下，Nrf2主要存在于胞浆中并与其抑制蛋白Keap1结合，保持着低活性状态。在氧化应激条件下，Nrf2从Keap1中释放并转移至细胞核，与细胞核内的抗氧化反应元件（ARE）结合，从而上调Ⅱ相解毒酶及抗氧化基因的表达[9]。HO1和NQO1是体内重要的Ⅱ相解毒酶和抗氧化剂，在体内发挥着重要的抗氧化作用。HO1是血红素生成胆绿素、一氧化碳和铁离子的限速酶。实验研究证实，促进Nrf2的核转移可上调HO1的蛋白表达[10]。NQO1是一种Ⅱ相解毒酶，同时也是辅酶Q（泛醌）和维生素E的还原酶，可通过维持辅酶Q和维生素E的还原状态来发挥抗氧化应激作用[11]。大量研究结果表明，激活Nrf2/ARE信号通路可以促进NQO1的蛋白表达[12]。本实验通过检测胞核Nrf2、胞浆Nrf2，Keap1及Nrf2下游抗氧化基因HO1和NQO1的蛋白表达，来研究latifolin发挥心肌保护作用的机制。实验结果显示，latifolin显著抑制Nrf2结合蛋白Keap1的蛋白表达，显著促进Nrf2的核转移，显著上调Nrf2的下游抗氧化基因HO1及NQO1的蛋白表达。结果表明，latifolin可能通过抑制Keap1的表达，使游离的Nrf2增多，同时促进游离的Nrf2向核内转移，通过上调Nrf2下游抗氧化基因的蛋白表达来发挥心肌保护作用。

缺血性心脏病的发病机制复杂，其中氧化应激是缺血性心脏病的重要发病机制之一。本研究结果显示latifolin对Pit及ISO诱导的大鼠急性心肌缺血模型具有保护作用，且高、中剂量的保护作用更为显著。进一步的机制研究结果显示，latifolin各剂量可显著减少ROS生成，同时latifolin高剂量显著抑制Keap1的表达、促进Nrf2核转移并促进HO1及NQO1的表达，表明latifolin的心肌保护作用可能与其激活Nrf2信号通路从而发挥抗氧化应激有关。然而也有研究表明latifolin在体外具有显著的抗炎作用[13]，因此latifolin是否也通過抑制炎症来发挥其心肌保护作用还不明确，即latifolin的抗氧化及抗炎作用与其心肌保护作用之间的关系还有待于进一步研究。虽然本课题对降香新黄酮latifolin发挥心肌保护作用的机制尚未完全明确，但无论如何，本实验为降香的进一步开发及抗心肌缺血药物的研究提供了实验依据。endprint

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[責任编辑张宁宁]endprint