楤木皂苷A在大鼠体内的组织分布研究

郭东艳　翟秉涛　吕杨　史亚军　范妤　王露　王媚

[摘要]楤木皂苷A为太白楤木中的主要活性成分之一。该文通过建立SD大鼠主要脏器中楤木皂苷A的LCMS/MS分析方法，同时口服灌胃楤木皂苷A 50 mg·kg-1，测定大鼠主要脏器（心、肝、脾、肺、肾、脑）中的楤木皂苷A含量，探讨体内的组织分布特征。结果显示楤木皂苷A在SD大鼠主要脏器中的方法学考察符合要求，口服灌胃楤木皂苷A 50 mg·kg-1，在心、肝、脾、肺、肾、脑组织均有分布且在1 h或2 h 时达到最大值。在给药后不同时间点楤木皂苷A的组织分布情况不同：给药20 min各组织含量：肝>心>脾>肺>肾>脑；给药1 h各组织含量：肝>脾>肾>肺>心>脑；给药2 h各组织含量：肝>肾>心>脾>肺>脑；给药4 h各组织含量：肾>肝>脾>心>肺>脑；给药8 h各组织含量：脾>心>肝>肾>肺>脑。提示楤木皂苷A主要分布于肝组织，这也与太白楤木常用于治疗肝脏疾病具有一定的相关性。另外，楤木皂苷A在脑组织中虽含量低但有明显分布，提示药物可能会透过血脑屏障，也为楤木皂苷A在脑组织的研究提供了依据。

[关键词]楤木皂苷A； 组织分布； HPLCMS/MS

[Abstract]Araloside A is one of the main active ingredients of Aralia taibaiensis In this study， HPLCMS/MS analysis method of araloside A in the main organs of SD rats was established At the same time， the content of araloside A in the main organs （heart， liver， spleen， lung， kidney， brain） after oral administration with araloside A （50 mg·kg-1） were determined to explore the tissue distribution characteristics of araloside A in vivo The results showed that the methodological study of araloside A in the main organs of SD rats met the requirements， araloside A distributed in heart， liver， spleen， lung， kidney and brain tissues reached peak at 1 h or 2 h after oral administration with 50 mg·kg-1The distributions of araloside A at different time points after administration were distinct as follows： the content of araloside A at 20 min：liver>heart>spleen>lung>kidney>brain； the content of araloside A at 1 h： liver>spleen>kidney>lung>heart>brain； the content of araloside A at 2 h： liver>kidney>heart>spleen>lung>brain； the content of araloside A at 4 h： kidney>liver>spleen>heart>lung>brain； the content of araloside A at 8 h： spleen>heart>liver>kidney>lung>brain Therefore， araloside A was mainly distributed in liver tissue， which had a certain correlation with the common use of Aralia taibaiensis in the treatment of hepatic disease In addition， araloside A shows a low content but an obvious distribution in brain tissues， which indicates that the drug can pass through bloodbrain barrier， and provides the basis for the study of araloside A in brain tissue

[Key words]araloside A； tissue distribution； HPLCMS/MS

楤木皂苷A（araloside A）為楤木属植物太白楤木Aralia taibaiensis的主要活性成分之一，含量约占太白楤木药材质量的12%，其化学结构见图1。具有抗溃疡、抗肿瘤、促纤溶、降血糖、抑制肾素活性等药理作用[15]。1961年，楤木皂苷A首次被前苏联学者Kochetkov N K等[6]从辽东楤木中分离得到，并运用化学法初步确定其结构。随后的几十年，有关楤木皂苷A的研究报道主要集中在药效方面，而相关的药代动力学研究仅有2篇报道，1篇是Iskenderov G B等[7]1991年发表，而另1篇Qi D等[8]以楤木皂苷A作为指标成分之一，对竹节参提取物进行药动学研究。众所周知，1个药物能否发挥药效，在一定程度上是由胃肠道的吸收和靶器官的浓度决定。药物口服吸收进入机体后，将通过循环系统转运至机体的各组织脏器中，药物分布的特征不仅与机体各部位的生理特征有关，而且与组织亲和力，化合物自身的理化因素等密切相关。这将使药物在体内各组织分布产生差异性，从而影响药物的治疗效果和药物的蓄积以及毒副作用[9]。课题组前期已对楤木皂苷A的体内吸收进行了相关研究。本文拟在前期研究基础上，探讨楤木皂苷A的组织分布特征，了解其在体内各主要器官的浓度，为药物的研究、开发及药物作用至靶器官或更理想的靶部位提供参考。endprint

1材料与方法

11仪器与试剂

岛津Nexera XR LC20AD 高效液相色谱仪（日本Shimadzu；Dgu20A3RDegassing Unit；SIL20AXRAutosampler；CTO20A Prominence Column Oven）；AB Sciex Qtrap 4500型质谱仪（美国AB Sciex公司）；GeneSpeed X1型微量离心机（香港基因有限公司）；BT25s型电子分析天平（天美控股有限公司）；miVac样品浓缩仪（英国GeneVac公司）。

楤木皂苷A（批号150916，纯度>98%，成都普菲德生物技术有限公司 ）；川续断皂苷Ⅵ（批号160211，纯度>98%，成都普菲德生物技术有限公司）；甲醇和乙腈（Adamas Reagent，色谱级）。

健康的SD大鼠30只，雌雄各半，体质量（230±20） g，购于第四军医大学动物试验中心，动物合格号SCXK（军）20120007。

12色谱质谱条件

121色谱条件色谱柱采用Hypurity C18（46 mm×150 mm，5 μm）；柱温35 ℃，流速08 mL·min-1，进样量5 μL，流动相A 01%甲酸水，B为乙腈，洗脱程序：0～6 min，35%～50% B；6～8 min，35% B；在203 nm波长下测定。

122质谱检测条件离子源采用ESI源；检测方式为负离子检测；采用MRM方式进行扫描；离子化电压-4 500 V，气帘气35 psi（1 psi=6895 kPa），离子源温度550 ℃，喷撞气Medium，喷雾气150 psi，辅助加热气250 psi。楤木皂苷A和内标的离子对及质谱参数，见表1。

13样品溶液的配制

楤木皂苷A储备液：精密称量楤木皂苷A 1 mg，用50%甲醇溶解，制成质量浓度约为1 000 mg·L-1的储备液。楤木皂苷A工作液：精密量取储备液5，10，25，50，100，250，500，1 000 μL于离心管中，加入50%甲醇配制成不同系列浓度工作液，使得楤木皂苷A的质量浓度为50～1万mg·L-1。川续断皂苷Ⅵ储配液：精密称量内标川续断皂苷Ⅵ 05 mg，用50%甲醇溶解，制成质量浓度约为50 mg·L-1的儲备液。川续断皂苷Ⅵ工作液：精密量取储备液适量于离心管中，加入50%甲醇，制成质量浓度约为2 mg·L-1的工作液。质量控制样品：精密量取楤木皂苷A 10 μL，添加川续断皂苷Ⅵ工作液10 μL于15 mL离心管内经浓缩仪干燥，再添加200 μL空白组织液，制得质量浓度约为5，500，4 000 mg·L-1的质量控制溶液。

14组织样品采集[1012]

清洁级雌雄各半的SD大鼠30只，给药前15 h禁食不禁水。以楤木皂苷A 50 mg·kg-1灌胃给药（给药体积为10 mL·kg-1），给药后分别在033，1，2，4，8 h处死，立即解剖采集心、肺、肝、脾、肾、脑；生理盐水洗净，置于-20 ℃冷冻保存。

15组织样品的处理[1315]

精密称取各组织05 g，用生理盐水洗净，2倍量蒸馏水匀浆，从中取200 μL组织液，添加10 μL的川续断皂苷Ⅵ，再添加乙腈600 μL涡旋2 min，13 000 r·min-1离心10 min后吸上清经浓缩仪干燥，200 μL色谱甲醇复溶残渣后过022 μm滤膜，吸5 μL进样分析。

16数据处理

采用Microsoft office Excel软件进行数据统计和处理。数据测定值采用均值±标准差表示。

2结果

21方法学考察[1618]

211专属性取空白肝脏、空白肝脏组织中添加楤木皂苷A（50 μg·L-1）和内标川续断皂苷Ⅵ（2 mg·L-1），实测肝脏组织样品（口服楤木皂苷A 2 h），按相应方法处理后进行分析，考察方法的特异性。结果表明，空白肝脏组织中没有物质干扰楤木皂苷A及川续断皂苷Ⅵ的测定，表明该方法的特异性良好，见图2。

212线性范围与定量下限精密吸取一定量的楤木皂苷A溶液，加入10 μL内标川续断皂苷Ⅵ溶液和200 μL空白组织液，配制成5，10，50，100，500，1 000，5 000 μg·L-1的楤木皂苷A标准添加组织样品，处理后进行加权（1/X2）计算，见表2。

最低检测限（LLOD）的S/N≥3；定量下限（LLOQ）的S/N≥10。取LLOQ浓度质控样品，按相应方法求出楤木皂苷A的浓度。

213精密度与准确度取3个不同浓度质控溶液，按相应方法求出楤木皂苷A的浓度。于1 d内测6次，3 d测3批，计算批内、批间 RSD（%）和RE（%），见表3。

214基质效应与提取回收率取空白组织液200 μL，先加入楤木皂苷A，再加入600 μL乙腈，涡旋离心后吸上清用浓缩仪干燥，取200 μL甲醇复溶残渣后过022 μm滤膜，吸5 μL进行分析，所得峰

A 空白肝组织匀浆液；B空白肝组织匀浆液加对照品及内标；C大鼠口服灌胃2 h后肝组织匀浆液；1楤木皂苷A；2川续断皂苷Ⅵ。

。

面积记为A。取空白组织液200 μL，先加入600 μL乙腈，涡旋离心后吸上清用浓缩仪干燥，再加入一定量楤木皂苷A，涡旋混匀2 min后过022 μm滤膜，吸5 μL进行分析得数据记为B。取用流动相配制的楤木皂苷A 50 μL，混合均匀，吸5 μL进行分析得数据记为C。楤木皂苷A的提取回收率=A/B×100%，基质效应=B/C×100%，见表4。

215稳定性①反复冻融：取3个不同浓度质控溶液，在-20 ℃和室温之间分别冻融 3 次，按相应endprint

方法算出楤木皂苷A的浓度，考察组织样品是否有影响；②进样室放置稳定性：取3个不同浓度质控样品，按相应方法在进样室放置6 h进样，考察组织样品是否受影响；③-20 ℃保存：取-20 ℃放置的3个不同浓度质控样品，在放置30 d后按相应方法在当天的标准曲线上求出楤木皂苷A的浓度，考察药物在组织中是否有影响；④4 ℃保存：取4 ℃保存的3个不同浓度质控样品，在放置24 h后按样品处理方法操作，在当天的标准曲线上算出楤木皂苷A的浓度，考察药物在组织中是否有影响，见表5。

22组织分布研究

SD大鼠口服给药楤木皂苷A（50 mg·kg-1），在各组织中的CT数据见表6。SD大鼠口服给药 50 mg·kg-1后，在心、肝、脾、肺、肾、脑组织均有分布且在1 h或2 h 时达到最大值。在给药后不同时间点楤木皂苷A的组织分布情况不同，给药033 h各组织含量：肝>心>脾>肺>肾>脑；给药1 h各组织含量：肝>脾>肾>肺>心>脑；给药2 h各组织含量：肝>肾>心>脾>肺>脑；给药4 h各组织含量：肾>肝>脾>心>肺>脑；给8 h各组织含量：脾>心>肝>肾>肺>脑。结果表明，楤木皂苷A在肝脏中的含量较其他组织高，在脑中的浓度相对较少。

3讨论

实验中组织样品的处理比较了甲醇、乙腈以及二者混合的沉淀效果，发现乙腈能够提供更高的回收率和更好的重现性，且组织匀浆液无其他物质干扰，而方法分析速度快，专属性好，操作简便，故最终选用色谱乙腈沉淀蛋白作为组织液的前处理方法。

本实验研究了口服灌胃楤木皂苷A后8 h内5个时间点的组织分布情况，包含组织分布的吸收、平衡和消除相。大鼠灌胃楤木皂苷A后，原型药物在不同组织的分布有着不同的速度与程度，脾、肺在给药1 h达峰，而心、肝、肾、脑在给药2 h达峰。口服后楤木皂苷A在肝脏中的药物浓度较高，提示与药物可能在肝脏中代谢有关；其次是肾脏，提示与药物主要在肾脏排泄相关，也可能与肝肾组织的血流大、循环好有关，因此楤木皂苷A的转运量也相应较大；接着依次为脾脏、心脏和肺。楤木皂苷A主要分布于肝脏，也与太白楤木常用于治疗肝脏疾病具有一定的相关性。另外，楤木皂苷A在脑组织中虽含量低但有明显分布，提示药物可能会透过血脑屏障，也为楤木皂苷A在脑组织的研究提供了依据。

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[責任编辑张燕]endprint