水酶结合溶剂浸提蔓荆子油工艺的研究

曾善荣，胡居吾

（1、赣州市食品药品检验检测中心，江西赣州 341000；2.江西省科学院应用化学研究所，江西南昌 330096）

水酶结合溶剂浸提蔓荆子油工艺的研究

曾善荣1，胡居吾2

（1、赣州市食品药品检验检测中心，江西赣州 341000；2.江西省科学院应用化学研究所，江西南昌 330096）

以蔓荆子为原料，采用水酶结合溶剂的方法从蔓荆子中提取蔓荆子油。考察了料液比、酶解时间及酶用量对蔓荆子油得率的影响，并采用响应面法建立了蔓荆子油得率与料液比、酶解时间及酶用量之间的关系，得到了最佳萃取工艺条件：液料比8.4:1、酶解时间105 min、酶用量1.1%，蔓荆子油的得率达到4.35%，本方法与直接用正己烷提取蔓荆子相比，所得蔓荆子油具有色泽透明、产品纯度高、收率高、污染少等的优点。

蔓荆子；响应面法

引言

蔓荆子别名：蔓荆实、荆子、万荆子、蔓青子、蔓荆、白背木耳、小刀豆藤、白背风、白背草。为马鞭草科植物单叶蔓荆或蔓荆的干燥成熟果实。主产于江西省、山东省、福建省和浙江省等省。具有解热、抗炎、镇痛、镇静、扩管和降压 、降血压、祛痰平喘、延缓衰老等功效[1-7]。

随着生物技术的日新月异以及酶制剂发展技术的成熟，其生产价格逐渐下降，使得它的利用越来越普遍。因此，将相关的酶制剂应用在植物精油方面越来越重视。采用酶法与溶剂浸提法提取蔓荆子油主要分为两个过程：首先是酶解过程，在反应酶的最适条件下，加入相关的酶进行酶解。其主要机理是酶使蔓荆子的细胞壁破碎从而加强蔓荆子细胞中蔓荆子油脂的流动性，便于蔓荆子油从蔓荆子细胞中游离出来。最后是浸提过程，当酶解结束后，向酶解液中加入少量正己烷溶剂，使酶解液中游离出来的蔓荆子油溶解在正己烷中，再利用漏斗分离和旋转蒸发得到蔓荆子油。

本文先进行单因素实验，再采用响应面优化实验以确定水酶结合溶剂法浸提蔓荆子油的最佳参数。本方法与直接采用正己烷提取蔓荆子油的方法相比，所得蔓荆子油具有色泽透明，杂质少、收率高、产品纯度高、污染小等的优点。

1 材料与方法

1.1 实验原料

蔓荆子，江西省都昌县。

1.2 仪器与试剂

木瓜蛋白酶(酶活力＞3万U/g)，纤维素酶（酶活力＞3万U/g），均购于上海蓝季科技发展有限公司；实验所用试剂均为分析纯。

B-260型恒温水浴锅，上海亚荣生化仪器厂；DEF-6020型电热恒温鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司；BSA-224S型分析天平，梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；TGL-20B-C型离心机，上海安亭科学仪器厂；PBS-3C型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；RE-52A型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 水酶结合溶剂浸提蔓荆子油[8]

将蔓荆子粉碎，将一定量的水加入粉碎后的蔓荆子中，用1mol/L盐酸调反应体系的pH在5.0，往反应体系中加入一定量的纤维素酶在设定的温度下进行酶解所需的时间后，再调节反应体系的pH值为6.5，随后将木瓜蛋白酶加入其中，再在所设定的温度下进行酶解所需的时间后，对反应体系进行灭酶处理。反应体系冷却后进行离心（离心转速为4 000 r/min，离心时间为10min），收集上层液，并加入适量的正己烷溶剂（用量为：蔓荆子重量/正己烷体积比=1:2，g/ml），然后在常温下进行萃取，萃取结束后去除正己烷溶剂，获得蔓荆子油产品。

1.3.2 蔓荆子油得率的测定

蔓荆子油的得率采用所获得的蔓荆子油油重与进行实验原料蔓荆子重的比值来测定，具体计算公式如下：

得率（%）=（蔓荆子油重/蔓荆子重）×100%

1.3.3 酶搭配方式的选择

反应体系中料液比为1:5，酶解时间为3h，酶解温度为50℃。表1是本实验当中酶的添加方式以及各酶的加入量和酶反应pH的值。

表1 酶的种类的筛选Table 1 The selection of enzyme

根据表1的实验方法进行实验，最后通过蔓荆子油的得率高低来确定较佳的酶种搭配方式。

1.3.4 提取工艺的单因素实验

1.3.4.1 料液比对蔓荆子油得率的影响

调节料液比分别为1:4、1:5、1:6、1:7、1:8，混合酶加入量为1.0%，pH6.0，酶解温度为50℃，酶解时间为2h。在不同料液比情况下测定并计算蔓荆子油得率。

1.3.4.2 酶解时间对蔓荆子油得率的影响

调节料液比为1:6，混合酶加入量为1.0%，酶解温度为50℃，酶解时间分别为1.0h、1.5 h、2h、2.5h、3.0 h，在不同酶解时间情况下测定并计算蔓荆子油得率。

1.3.4.3 纤维素酶加入量对蔓荆子油得率的影响

调节料液比为1:6，酶解温度为50℃，酶解时间为2h，酶用量分别为0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%，在不同酶用量情况下测定并计算蔓荆子油得率。

1.3.5 工艺的优化

通过单因素实验确定的最佳的酶加入量、料液比和酶解时间，根据响应面实验设计三个因素（酶加入量、料液比和酶解时间）在三个不同的水平上的响应面优化实验。通过软件分析，获得水酶法结合溶剂浸提蔓荆子油的最优工艺条件。

2 实验结果与讨论

2.1 酶的筛选

根据实验设计，通过测定蔓荆子油的得率高低来确定较佳的酶种搭配方式，根据具体实验数据利用Origin7.0所做的图表如图1。

图1 不同的酶对的蔓荆子油的得率的影响Fig.1 Effect of different enzymes on the yield of viter rotundifolia oil

蔓荆子细胞壁主要由半纤维素和纤维素组成，此外，还含有少量的蛋白质等。存在于蔓荆子细胞内的油脂与一些蔓荆子蛋白质相结合，从而大大的降低了游离态的蔓荆子油。因此，我们选择了纤维素酶和木瓜蛋白酶为浸提蔓荆子油所用的酶。由图1可以看出：单一的使用木瓜蛋白酶和单一的使用纤维素酶时，与混合酶（木瓜蛋白酶：纤维素酶=1：1）使用时，其得率都比混合酶的得率低。因为纤维素酶对纤维素和半纤维素物质会进行酶解作用，同时，木瓜蛋白酶会使与蛋白结合的油脂分离开出，从而两种酶的结合使用，使蔓荆子中结合态的油脂会游离出来，增加了正已烷溶剂的浸提效率。因此，我们选择混合酶（木瓜蛋白酶：纤维素酶=1：1）为水酶结合溶剂浸提蔓荆子油的过程当中的酶添加方式。

2.2 料液比对蔓荆子油得率的影响

在不同料液比情况下测定并计算蔓荆子油得率。结果见图2。

图2 料液比对蔓荆子油得率的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the yield of viter rotundifolia oil

由图2可知，在反应体系中，料液比在1:4-1:6范围内，蔓荆子油的得率会随着料液比的增加而提高，得率由2.38%(料液比1:4)增大到3.51%(料液比1:6)。当料液比低于1:4时，加入的酶和底物蔓荆子粉末几乎黏在一起，所加入的酶发挥不了作用。只有当反应体系中的料液比超过1:4后，加入的酶和底物蔓荆子粉末充分发生酶解作用，使蔓荆子细胞的细胞壁得到破坏，并且使得蔓荆子中与蛋白结合的油脂之间的作用力减小，因此，蔓荆子中大量的油脂被游离出来[8]。当料液比达到当料液比高于1：6时，蔓荆子油提取率反而下降，因为随着料液比的进一步变大，酶作用底物的浓度却开始下降，从而使酶解速率下降，导致蔓荆子油的提取率下降。从以上的实验结果确定水酶法提取蔓荆子油的料液比为1:6。

2.3 酶解时间对蔓荆子油得率的影响

在不同酶解时间情况下测定并计算蔓荆子油得率。结果见图3。

图3 酶解时间对蔓荆子油得率的影响Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of viter rotundifolia oil

由图3可知，酶解时间在1.0h到2.0h的范围内，酶解时间越长，所得到的蔓荆子油得率增加，当酶解时间为1.0h时，所得的蔓荆子油得率为1.98%，当酶解时间到达2.0h时，所得的蔓荆子油得率达到3.42%。但是，当反应体系中的酶解时间超过2h以后，蔓荆子油得率反而会略有下降，因为随着酶解时间的延长，体系中游离出来的蔓荆子油会与一些蛋白质和其他色素等杂质相结合在一起，使蔓荆子油的得率会有所降低。因此，综合考虑，选择复合酶酶解时间为2h。

2.4 酶用量对蔓荆子油得率的影响

调节料液比为1:6，酶解温度为50℃，酶解时间为2h，酶用量分别为0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%，在不同酶用量情况下测定并计算蔓荆子油得率。结果见图4。

图4 酶用量对荆子油得率的影响Fig.4 Effect of dosage of enzyme on the yield of viter rotundifolia oil

从图4.可看出，在加酶量在1.0%以内，反应体系中蔓荆子油的得率随着加酶量的增多而逐渐增大。但当反应体系中的加酶量(E/S)超过1.0%之后，蔓荆子油的得率会有所增加，但其数值不明显。因为在反应体系中，底物浓度已确定的情况下，反应速率与酶浓度存在正比例关系，反应体系中的酶解率会随着加酶用量的增多而增加，当反应体系中的底物耗尽后，再增加酶的量时，蔓荆子油的得率也不再增加，因此，从生产成本上考虑，选择最佳酶用量为1.0%。

2.5 工艺的优化

2.5.1 响应面分析法因素水平表及其分析和实验结果

在单因素试验基础上选取液料比、酶解温度及酶用量对本试验有关的影响因素进行响应面分析，具体见表2。实验结果见表3和表4。

表2 响应面试验因素水平及编码Table2 Levers and code of response surface experiments

表3 蔓荆子油响应面分析方案及结果Table 3 Analysis and result of response surface experiments

设该模型通过最小二乘法拟合的二次多项方程为：

式中：Y—预测响应值；X0—常数项；X1、X2、X3—线性系数；X12、X13、X23—交互项系数；X11、X22、X33—二次项系数

表3为不同试验条件下所测定的蔓荆子油的得率，利用Design-expert 7.0 软件对表3中蔓荆子油的各条件下的得率进行多元回归拟合，表4为回归方程系数及其显著性检验结果，当 “Prob＞F” 值小于 0.05时，即表示该项指标具有显著性，可以用于蔓荆子油萃取试验的理论预测。多项回归方程为：

表4 回归方程系数及其显著性检验结果Table 4 Regression coefficients and their significance

2.5.2 响应面实验的直观分析

相应曲面图和等高线图5所示。

图5 y=f(x1，x2)的响应面与等高线图Fig.5 Response surface plot and contour plot

由图5可以看出：在固定两个因素（水平值为0）水平值时，其他因素的3D曲面图的总体形状较相似，表现出的变化规律为这两个因素均是随另一个因素水平值的变化而先变大后减小，混合酶加入量因素的影响较为显著。通过软件 Design – Expert7.0求解方程，给出了最佳酶解工艺条件为：液料比8.4:1、酶解时间105h、酶用量1.1%，对优化条件进行实验验证，重复3次，此时蔓荆子油的得率达到极值4.35%，与理论计算值误差在0.5%左右。

[1]雷载权.中药学[M].上海:上海科学技术出版社，2000，44.

[2]南京药学院《中草药学》编写组.中草药下册[M].南京：江苏科技出版社，1980：914.

[3]隋在云，王爱洁.蔓荆子解热作用的实验研究[J].中药药理与临床,2007,23(5) :138-139.

[4]Ikawati Z,Wahyuono S,Maeyama K.Screening if several Indonesian medicinal plants for their inhibitory effect on histaminere lease from RBL-2H3 cells[J].Ethnopharmacol,2001,75:249-256.

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[7]陈奇,连晓媛,毕明,等.蔓荆子药理作用研究[J].江西中医药,1991,2(1) :47-50.

[8]史素伟.酶法提取米糠油和蛋白及米糠油微胶囊化研究[D].南昌大学，2011.

Optimization for the extracting Viter rotundifolia oil by the combination of water and enzymes

Zeng Shan-rong1，Hu Ju-wu2
(1、Ganzhou Provincial Institute For Food And Drug Control,Jiangxi Ganzhou 334100；2、Institute of Applied Chemistry,Jiangxi Academy of Sciences,Jiangxi Nanchang 330096)

The viter rotundifolia oil was extracted by the combination of water and enzymesfrom viter rotundifolia.The major influence factors such as solid-liquid ratio,Enzymatic hydrolysis time,dosage of enzyme were studied and analysised.By employing response surface methodology,the relationship of solid-liquid ratio,enzymatic hydrolysis time,dosage of enzyme was founded.The parameters of extraction process were optimized,so the optimal experiment parameters are:solid-liquid ratio 8.4:1,enzymatic hydrolysis time 105min,dosage of enzyme 1.1%.The method is high yield and high product purity and low pollution characteristics

viter rotundifolia;Response Surface Method

TS22

A

2096-0387（2017）05-0005-05

江西省科技支撑项目（项目编号201302417）。

曾善荣（1981-），男，工程师，研究方向：食品工程与检测。