蔓荆子炮制前后HPLC指纹图谱比较研究

李国卫，吴文平，索彩仙，孙冬梅，何民友，潘礼业

(广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244)

蔓荆子为马鞭草科植物单叶蔓荆VitextrifoliaL. var.simplicifoliaCham.或蔓荆VitextrifoliaL.的干燥成熟果实。秋季果实成熟时采收，除去杂质，晒干[1]。炒蔓荆子用药始见于《圣惠》，以微炒居多，以除去宿萼及白膜等非药用部位，使之饮片碎制、净制，尚有缓和药性、便于制剂、达到易于煎出有效物质的目的[2]。蔓荆子具有疏散风热、清利头目的功效，炒制之后功效侧重于升清阳之气，较多的运用于耳目失聪及风湿痹痛的治疗[3]。

蔓荆子的化学成分主要包括挥发油、双萜类化合物、黄酮类化合物、氨基酸、脂肪酸等[4-9]。2015年版《中国药典》以蔓荆子黄素作为蔓荆子与炒蔓荆子的定量分析指标。文献研究显示，蔓荆子炮制后黄酮类成分含量会下降，而水溶性浸出物会增加，因此采用蔓荆子黄素作为蔓荆子炮制的质量控制标准不能全面反映蔓荆子炮制品的质量[8,10-11]。为进一步研究炮制前后蔓荆子化学成分变化，并有效地控制其饮片的质量，本研究采用高效液相色谱法对蔓荆子、炒蔓荆子指纹图谱进行了研究，为更好地控制蔓荆子和炒蔓荆子的药材质量提供依据。

1 材料与仪器

WatersARC高效液相色谱仪(Waters公司)；Agilent SB C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；ME204E万分之一分析天平(梅特勒-托利多公司)；XP26百万分之一分析天平(梅特勒-托利多公司)；KQ500DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HWS28型恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)；Milli-Q Direct超纯水系统(默克股份有限公司)。

异荭草苷(质量分数94.0%，批号：111974-201401)、蔓荆子黄素(质量分数99.7%，批号：111554-201304)、香草酸(质量分数99.80%，批号：110776-201503)均由中国食品药品检定研究所提供；磷酸、乙腈为色谱纯(默克股份有限公司)；水为超纯水(实验室自制)；其他试剂为分析纯。

17批蔓荆子样品来源于江西、云南、湖北、广东等地，经广东一方制药有限公司魏梅主任中药师鉴定为马鞭草科植物单叶蔓荆VitextrifoliaL. var.simplicifoliaCham. 或蔓荆VitextrifoliaL.的干燥成熟果实，炒蔓荆子为实验室自制，样品留存于广东一方制药有限公司质量中心，其中生品编号为：S1～S17，对应的炒蔓荆子编号为：PS1～PS17。

2 方法与结果

2.1 炒蔓荆子的制备

取蔓荆子200 g，按2015年版《中国药典》炒蔓荆子项下规定：取净蔓荆子，照清炒法(通则0213)微炒，炒至表面黑褐色，气特异而芳香，味淡、微辛，符合2015年版《中国药典》中炒蔓荆子的性状特征[1]。

2.2 色谱条件

色谱柱为Agilent SB C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱(0～30 min，5%→20%A；30～40 min，20%→45%A；40～50 min，45%→95%A；50～60 min，95%A)；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长为258 nm；进样体积为10 μL。

2.3 对照品溶液的制备

取蔓荆子黄素对照品、异荭草苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL分别含蔓荆子黄素103.189 5 μg、异荭草苷114.539 0 μg的混合对照品溶液，即得；另取香草酸对照品适量，加甲醇制成每1 mL含40.538 8 μg的香草酸对照品溶液，即得。

2.4 供试品溶液的制备

取蔓荆子样品粉末(过三号筛)适量，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%(体积分数，下同)乙醇25 mL，称定质量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，用50%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性试验 取上述蔓荆子供试品溶液、混合对照品溶液依次进样检测，考察实验方法的专属性。结果表明，样品中各个色谱峰不受空白溶剂的干扰，其中蔓荆子黄素、异荭草苷、香草酸的保留时间与对照品色谱峰的保留时间一致，表明该方法具有良好的专属性，结果见图1。

5.香草酸； 8.异荭草苷； 14.蔓荆子黄素； A.香草酸对照品溶液； B.蔓荆子黄素与异荭草苷混合对照品溶液； C.蔓荆子供试品溶液； D.炒蔓荆子供试品溶液。

图1 对照品与供试品溶液HPLC图

Figure 1 The HPLC spectra of the mixed reference substance and the sample

2.5.2 精密度试验 精密吸取“2.4”项下同一供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，以蔓荆子黄素为参照峰，计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积RSD值分别为0.02%～0.11%、0.13%～0.53%，表明分析方法精密度良好。

2.5.3 重复性试验 取同一蔓荆子样品，按“2.4”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，以蔓荆子黄素为参照峰，计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积RSD值分别为0.03%～0.13%、0.89%～1.86%，表明方法重复性较好。

2.5.4 稳定性试验 取精密吸取“2.4”项下同一供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、12、24 h，按“2.2”项下色谱条件测定，以蔓荆子黄素为参照峰，计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积RSD值分别为0.03%～0.17%、0.22%～0.50%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6 蔓荆子药材指纹图谱的建立

2.6.1 共有峰的确定 精密称取不同批次蔓荆子及炒蔓荆子约0.5 g，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下的色谱条件依次进样测定，以峰面积大于总峰面积的0.35%筛选色谱峰，通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行匹配，共得到15个稳定的共有峰，具有指纹图谱特征性，可初步拟定为蔓荆子的指标成分群，分别得到蔓荆子及炒蔓荆子的指纹图谱，见图2、图3。经对照品对照，5号峰为香草酸峰，8号峰为异荭草苷峰，14号峰为蔓荆子黄素峰。蔓荆子黄素峰因分离效果好、出峰稳定，选定为参照峰。以14号峰蔓荆子黄素峰为参照峰，计算各批蔓荆子与炒蔓荆子的共有峰的相对峰面积，结果见表1。可见，各共有峰的RSD值范围为22.86%～87.86%，较为稳定，具有特征图谱特征性，可初步定为蔓荆子的指标成分群。

2.6.2 蔓荆子和炒蔓荆子相似度计算 分别通过17批蔓荆子和17批炒蔓荆子生成的共有模式为对照指纹图谱，计算各批次之间的相似度，结果见表2。可见，17批蔓荆子的相似度在0.850～0.999之间，17批炒蔓荆子的相似度在0.894～0.997之间，说明蔓荆子与炒蔓荆子的质量稳定，生品与生品、炮制品与炮制品之间成分组成差异小。

5.香草酸； 8.异荭草苷； 14.蔓荆子黄素； S1～S17分别为17批蔓荆子生品。

图2 17批蔓荆子生品HPLC指纹图谱叠加图

Figure 2 Superposition chart of HPLC specific chromatograms of 17 batches of Viticis Fructus

5.香草酸； 8.异荭草苷； 14.蔓荆子黄素； S1～S17分别为17批炒蔓荆子样品。

图3 17批炒蔓荆子样品HPLC指纹图谱叠加图

Figure 3 Superposition chart of HPLC specific chromatograms of 17 batches of fried Viticis Fructus

表1 蔓荆子生品及炒蔓荆子样品指纹图谱相对峰面积分析结果Table 1 Relative peak area of characteristic spectrum of Viticis Fructus and fried Viticis Fructus

表1 (续)

注：S1～S17为蔓荆子生品，PS1～PS17为炒蔓荆子。

表2 蔓荆子生品及炒蔓荆子指纹图谱相似度结果Table 2 Similarity of fingerprints of Viticis Fructus and fried Viticis Fructus

注：S1～S17为蔓荆子生品，PS1～PS17为炒蔓荆子。

2.6.3 蔓荆子与炒蔓荆子各特征峰相对峰面积差异分析 对蔓荆子及炒蔓荆子特征图谱的相对峰面积进行直观分析，结果见图4。可见，17批蔓荆子与炒蔓荆子特征图谱的15个共有峰中，峰6、峰7、峰8、峰9、峰13等5个色谱峰的相对峰面积呈整体降低趋势；峰1、峰2、峰3、峰5、峰15等5个色谱峰的相对峰面积呈整体增大趋势；峰4、峰10、峰11等3个色谱峰的相对峰面积则有升有降，无明显规律。运用SPSS 20.0软件对蔓荆子及炒蔓荆子各特征峰峰面积进行独立样本t检验，结果见表3。可见，峰2、峰6、峰7、峰15的相对峰面积存在明显差异(P<0.05)。基于统计分析结果与直观分析结果一致，说明蔓荆子与炒蔓荆子的成分比例存在差异。

MJZ.蔓荆子生品；CMJZ.炒蔓荆子。

A.峰1、峰2、峰3、峰5、峰15相对峰面积均值图； B.峰6、峰7、峰8、峰9、峰13相对峰面积均值图。

图4 蔓荆子及炒蔓荆子相对峰面积均值对比图

Figure 4 Comparison charts of relative peak area mean of Viticis Fructus and fried Viticis Fructus

3 讨论

本研究采用全波长扫描(190～400 nm)确定检测波长，结果显示在258 nm波长下色谱峰数目最多，色谱峰分离度较好，故测定波长选择258 nm，并最终建立蔓荆子及炒蔓荆子指纹图谱；并对不同提取方法(超声、回流)及不同提取溶剂(甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇、50%甲醇、50%乙醇)进行比较，结果发现采用50%乙醇回流提取的色谱图信息量最多，峰响应较高，故选用50%乙醇回流提取。

表3 蔓荆子及炒蔓荆子各特征峰相对峰面积独立样本检验结果

Table 3 The independent sample test result of relative peak area of each characteristic peak of Viticis Fructus and fried Viticis Fructus

峰号t值dfP值峰1-1.98832峰2-2.77132<0.05峰3-1.93432峰40.82332峰5-0.45032峰64.37832<0.05峰73.09032<0.05峰80.87232峰90.70332峰100.56932峰110.89032峰12-0.69032峰130.88332峰15-6.32432<0.05

本研究结果显示，17批蔓荆子与炒蔓荆子特征图谱的15个共有峰中，峰6、峰7、峰8、峰9、峰13等5个色谱峰的相对峰面积呈整体降低趋势；峰1、峰2、峰3、峰5、峰15等5个色谱峰的相对峰面积呈整体增大趋势；峰面积出现明显变化的色谱峰主要集中在特征图谱前30 min的部分，其中峰5为香草酸，峰8为异荭草苷，前30 min的成分多为极性较大的水溶性成分，与文献研究的水溶性浸出物会增加的结论有一定关联[10]；但黄酮类成分异荭草苷相对峰面积呈现降低趋势，提示蔓荆子中部分黄酮类成分炮制后含量可能会降低。

2015年版《中国药典》蔓荆子项下并未对蔓荆子、炒蔓荆子进行系统的鉴别，本实验通过对不同产地蔓荆子、炒蔓荆子的指纹图谱进行分析，为蔓荆子及炒蔓荆子的质量标准制定、品质评价提供一定的科学依据，为蔓荆子的质量控制提供了参考方法。本研究尚未对炮制前后产生变化的成分进行深入研究，后续将针对炮制后产生变化的化学成分进行指认，并开展蔓荆子炮制前后药效对比研究，进一步揭示蔓荆子炒制的科学内涵。