大黄醇提物对嗜水气单胞菌抑菌活性及其机制

周 亮， 谢丽玲， 朱 琳， 朱炎坤， 韩光耀， 毕 萧， 彭 齐

(汕头大学 理学院，广东 汕头 515063)

大黄醇提物对嗜水气单胞菌抑菌活性及其机制

周 亮， 谢丽玲*， 朱 琳， 朱炎坤， 韩光耀， 毕 萧， 彭 齐

(汕头大学 理学院，广东 汕头 515063)

研究大黄醇提物对嗜水气单胞菌的抑菌活性及机制。主要采用牛津杯法和液体倍比稀释法；通过扫描电镜、SDS-PAGE、二维电泳及串联质谱等方法探讨大黄醇提物对嗜水气单胞菌的抑菌机制。结果显示，大黄醇提取物对嗜水气单胞菌有明显的抑制效果，抑菌圈为(24.5±0.2) mm，MIC和MBC均为3.91 mg/mL；在药物作用下，菌体表面变粗糙，细胞膜受损并出现破裂；在经药物处理4 h后，细菌蛋白含量明显下降(P<0.05)，2-DE电泳发现3个差异性蛋白。结果表明，大黄醇提物对嗜水气单胞菌的抑制作用机制是破坏其细胞膜结构及影响特定蛋白的表达。

大黄；嗜水气单胞菌；抑菌活性；机制

自然界中广泛存在的嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila) 对鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类等动物具有很强的感染作用,在临床上表现为急性出血性败血症的主要特征[1-3]。近年来，人们大量使用化学药物如消毒剂和抗生素来防治嗜水气单胞菌对水产动物的危害，导致药物残留、破坏动物免疫力以及体内微平衡等毒副作用，既危及水产动物的健康，又危害人类的健康。因此寻找绿色有效抑菌物质越来越引起人们关注[4-9]。 大黄隶属蓼科植物，也称锦纹、黄良，别名将军、生军、马蹄黄，主要活性成分包括大黄素、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素和土大黄素等，是一类蒽醌衍生物，还有多种有机化合物和无机物。大量研究表明大黄对幽门螺旋杆菌、厌氧菌、真菌有明显抗菌作用，是广谱的抗菌中药。中药具有毒副作用小、取材方便、不易产生耐药性等优点，因此采用中药防治疾病，对发展水产动物无公害养殖，开发绿色抗菌药物有着十分重要的意义[10-12]。本文研究了大黄对致病性嗜水气单胞菌的抑菌活性及机制，为开发低毒高效、用于水产养殖的绿色抗菌新药提供参考。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 供试菌株 嗜水气单胞菌(A.hydropila)XX-25，南京农业大学刘永杰教授惠赠，本实验室保存。

1.1.2 LB培养基(质量分数，%) 酵母粉0.5，蛋白胨1，氯化钠1。

1.1.3 试剂 甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、尿素、CHAPS、DTT、十二烷基硫酸钠、三羟甲基氨基甲烷、溴酚蓝、Bio-Lyte、考马斯亮蓝R-250等购自上海sangon生物工程有限公司，甲醇、甘油、无水乙醇、正丁醇、浓盐酸、冰乙酸等购自汕头西陇化工有限公司。

1.1.4 仪器与设备 TDL-5-A型低速大容量离心机(上海安亭科学仪器厂)；UVmini-1240紫外可见分光光度计(岛津国际贸易(上海)有限公司)；SPX-250B型生化培养箱(上海跃进医用光学仪器厂)；JSM-6360LA扫描电镜(日本电子)；等电聚焦电泳仪(上海普迪生物技术有限公司)。

1.2方法

1.2.1 大黄醇提物的制备 大黄烘干12 h后进行粉碎，精确称取大黄粉末5.0 g，用50 mL 70%乙醇在圆底烧瓶中80 ℃回流提取2次，每次1 h，合并提取液，旋转蒸发仪浓缩至浓度为0.5 g/mL，用0.22 μm水系滤膜过滤除菌后置于4 ℃冰箱保存。

1.2.2 大黄醇提物对嗜水气单胞菌敏感性试验 ①牛津杯法[13]：取对数期约107cfu/mL的细菌菌液100 μL稀释，均匀涂布平板，牛津杯中加入大黄醇提物200 μL，阴性对照为无菌水，阳性对照为20 μg/mL氨苄青霉素。37 ℃培养16 h后观察，测定抑菌圈大小。②最低抑菌浓度(MIC)测定[14-17]：采用液体倍比稀释法测定中药粗提液的最低抑菌浓度，阴性对照加入等量的无菌水，不浑浊的最低药物浓度为 MIC 值。③最低杀菌浓度(MBC)测定：根据MIC的结果，将培养液划线于LB培养基上。平皿内无细菌生长的药物浓度为MBC值。

1.2.3 抑菌机制的研究 ①菌体形态观察[18-21]：将培养至对数期的嗜水气单胞菌按2%接种量接种到3.91 mg/mL(MIC)提取液的培养液中，以不加药液为对照。37 ℃摇床培养4、6、8 h后分别取样，离心去上清，2.5%的戊二醛4 ℃固定过夜后用0.2 mol/L的PBS(pH=7.4)洗3次，然后依次用30%、50%、60%、85%、90%、100%乙醇脱水1次，每次15 min，最后涂片，干燥，喷金，在扫描电镜下观察。②丙烯酰胺凝胶电泳和细胞可溶性蛋白含量的测定：将培养至对数期的嗜水气单胞菌按2%接种量接种到3.91 mg/mL提取液的培养液中，以不加药液为对照组。37 ℃摇床培养，收集4、6、8、10 h菌体后超声破碎提取蛋白。选用10%分离胶、5%浓缩胶，用0.5%考马斯亮蓝 R-250进行染色，上样量为25 μL。可溶性蛋白浓度用Bradford法测定，每组测定3次。③双向电泳及质谱的分析[22-24]：第一向等电聚焦，将提取的样品与水化液混合(1∶4)总体积250 μL，吸入到IPG胶条槽中，水化和聚焦在20 ℃自动进行。等电聚焦结束、胶条进行平衡完后，进行SDS-PAGE电泳。第二向SDS凝胶采用分离胶10%、浓缩胶5%的不连续垂直板电泳。电泳结束，取出凝胶，进行染色。用脱色液在摇床上进行脱色过夜，纯水漂洗3次，凝胶图像扫描仪获取图片，使用PDQuest软件对图片进行强度校正、背景消减、点检测、点匹配等分析。将特异性点送到深圳市维纳菲生物技术有限公司进行质谱检测。

2 结果与分析

2.1敏感性试验

大黄醇提物对嗜水气单胞菌敏感性试验结果显示，用0.5 g/mL大黄醇提物对嗜水气单胞菌的抑制活性明显，结果见表1。大黄醇提物所形成的抑菌圈直径为(24.5+0.2) mm，说明大黄醇提物对嗜水气单胞菌有很好的抑制效果。MIC是评价抗菌药物抑菌活性的指标，MBC则是指将细菌杀死的最低药物浓度。结果显示大黄醇提物对嗜水气单胞菌的MIC和MBC的结果为3.91 mg/mL。

表1 嗜水气单胞菌的抑菌圈

2.2扫描电镜观察结果

扫描电镜镜像观察结果见图1。大黄处理4 h后有部分菌体的形态发生明显变化(箭头所指)，部分细菌出现裂解(图1a1)。对照组(图1a)的菌体为长杆状，表面光滑，形态饱满，没有细胞破损情况。然而处理6、8 h后，正常细胞逐渐变多，大部分细胞呈正常形态。说明大黄醇提物对嗜水气单胞菌的细胞膜有一定影响，可能是破坏了细胞膜的完整性，细胞内渗透压的改变，最终导致细菌破裂死亡。

图1 嗜水气单胞菌的扫描电镜观察结果Fig.1 SEM results of Aeromonas hydrophilaa,b,c：对照组4、6、8 h电镜图；a1、b1、c1处理组4、6、8 h电镜图a,b,c:Controls of different time in fourth,sixth,eighth；a1,b1,c1:treated with ethanol-extracts from Rhubarb of different time in fourth,sixth,eighth

2.3细菌蛋白测定

用SDS-PAGE检测大黄醇提物对嗜水气单胞菌蛋白的影响，结果显示，处理组与对照组在分子量20 KD附近的条带有明显差异(图2)，表明经大黄醇提物作用后，嗜水气单胞菌蛋白的表达在4、6、8、10 h中受到不同程度影响，处理组的蛋白条带变淡，这可能是某些蛋白在表达上受到了抑制。经Bradford法测其蛋白浓度，结果如图3所示。在4、6、8、10 h时，处理组总蛋白含量有变化，且4 h蛋白含量变化显著(P<0.05)，说明大黄醇提物对嗜水气单胞菌的蛋白表达量也产生了影响。

图2 可溶性蛋白的SDS-PAGEFig.2 Solubility proteins of SDS-PAGEM：Makre；a、b、c、d：对照组4、6、8、10 h的蛋白；1、2、3、4：处理组4、6、8、10 h的蛋白M: Maker；a，b，c，d:Controls of different time in fourth,sixth,eighth,tenth hour；1,2,3,4：treated with ethanol-extracts from Rhubarb of different time in fourth,sixth,eighth,tenth hour

2.42-DE及质谱结果

通过细菌蛋白双向电泳后，用凝胶图像扫描仪获取图像(图4)，结果显示，在分子量20 KD附近有3个明显的蛋白差异点，取这3个点进行质谱分析，结果如表2所示。结合质谱结果发现图4中点1是转录延长因子GreA(transcription elongation factor GreA)，细菌在mRNA合成时，转录延长因子与RNA聚合酶结合参与延长阶段，为细菌的蛋白质合成做准备。大黄醇提物处理后，转录延长因子GreA的表达量出现极度下调，转录延长因子不够，会使得RNA聚合酶无法在DNA上滑动，mRNA合成受阻，最后蛋白质不能正常合成，影响细菌生命活动。图4中点2是超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)，超氧化物歧化酶是除去机体内氧自由基的重要酶，它的量不足，会导致细胞无法承受氧自由基的胁迫，影响细菌的正常生理功能。图4中点3是烷基氢过氧化物还原酶亚基C(alkyl hydroperoxide reductase subunit C，Ahp C)，这也是细菌抵抗氧化胁迫的主要蛋白组成成分之一，一旦外界环境恶劣时，此蛋白为了适应外界的胁迫而过量表达。

图3 细菌经大黄醇提物处理后蛋白释放情况Fig.3 Leakage of protein from bacteria after treatment with ethanol extracts of Rhubard

图4 嗜水气单胞菌的2-DE图谱Fig.4 The 2-DE of Aeromonas hydrophilaa、b分别代表4 h的对照组、4 h的处理组a:control;b:treated with ethanol-extracts from Rhubarb

编号结果BLAST结果Mr(Da)/pI分数覆盖率/%对比的肽段1gi|491497280转录延长因子GreA17671/4．6530858%152gi|644513742超氧化物歧化酶21598/5．5549848%143gi|491479594烷基氢过氧化物还原酶亚基C20776/5．03737100%32

3 讨 论

菌体细胞膜是具有高度选择透过性膜，其通透性发生改变会影响细胞的正常生理功能[25-27]。研究表明，大黄醇提物处理嗜水气单胞菌4 h后，通过电镜观察，发现细菌表面出现不规则的皱痕，部分细菌的膜已破裂，影响了细菌结构的稳定和能量代谢，最终影响了细菌的正常生理功能。

双向电泳技术是蛋白质组学研究的核心技术之一。它利用各种蛋白质等电点和分子量的不同来分离复杂蛋白质组分。本研究应用双向电泳获得了嗜水气单胞菌的2-DE 图谱，并选取了3个高丰度且差异性明显的蛋白点进行质谱分析。该3个蛋白点分别为转录延长因子GreA、超氧化物歧化酶、烷基氢过氧化物还原酶亚基C。大量文献表明，这3个蛋白对细菌的正常生理及其结构极为重要。如Kun等[28]认为伸长GreA是细菌RNA聚合酶不可或缺的复杂因子之一，它在转录延伸中扮演多个角色。石磊等[29]认为超氧化物歧化酶广泛存在于微生物、动物和植物等多种生物体内，超氧化物歧化酶通过清除机体超氧自由基，达到保护机体免受超氧自由基伤害。V. Leclère等[30]也表明超氧化物歧化酶能抵抗外界氧压力，保护细菌免受外部超氧化物的作用。Ahp C蛋白属于巯基依赖2-Cys过氧还原家族蛋白，是细菌中抵抗氧化胁迫的主要蛋白之一，在幽门螺杆菌中是最主要的抗氧化蛋白，细菌Ahp C可自聚合形成大分子的聚合体，同时开始获得分子活性[31]。研究大黄醇提物对嗜水气单胞菌蛋白表达的结果显示，药物处理后，这些蛋白出现差异表达，而作为生命活动重要的这三种蛋白的非正常表达，使得细菌生命体的正常活动受到影响。 本研究发现大黄醇提物对嗜水气单胞菌有很好的抑制活性，并且其抑菌机制主要破坏其细胞膜结构及影响特定蛋白的表达。

[1] GB/T 18652-2002,中华人民共和国国家标准《致病性嗜水气单胞菌检验方法》[S].2002.

[2] 吕爱军,李任年,余为一.嗜温气单胞菌研究进展[J].中国动物检疫, 2000,(11):42-43.

[4] 李国旺,苗志国,赵恒章.大黄的体外抑菌实验[J].光谱实验室,2011,28(1)：66-68.

[5] Singh V,Chaudhary DK,Mani I,et al.Development of diagnostic and vaccine markers through cloning,expression,and regulation of putative virulence-protein-encoding genes of Aeromonas hydrophi-la[J]. The Journal of Microbiology,2013,51(3): 275-282.

[6] Vaseeharan B,Thaya R.Medicinal plant derivatives as immunos-timulants: an alternative to chemotherapeutics and antibiotics in aquaculture[J]. Aquaculture international,2014,22(3): 1079-1091.

[7] Su HC,Ying GG,Tao R,et al. Occurrence of antibiotic resist-ance and characterization of resistance genes and integrons in En-terobacteriaceae isolated from integrated fish farms in south China[J]. Journal of environmental monitoring,2011,13(11):3223 -3229.

[8] 谢丽玲,彭齐,蔡链纯,等.黄芩醇提物对副溶血性弧菌抑制机制的研究[J].生物技术通报,2015,31(8):159-165.

[9] 陈晴,谢鲲鹏,云宝仪,等.黄柏等中草药对MRSA的抑菌作用及其对质粒的消除作用[J].微生物学杂志，2013,33(3):54-57.

[10] 马建凤,刘华钢,朱丹.中药体外抑菌研究的方法学进展[J].药物评价研究,2010,33(1):42-45.

[11] 刘蓓蓓.大黄中有效成分的提取、分离测定及其抗突变作用[J].中国医药指南,2013,11(6):63-65.

[12] 李淑娟,董晓华,武海霞,等.大黄及其有效成分药理作用研究进展[J].医学综述,2005,11(1)：76-78

[13] 刘健,王海雁,赵淑江.牛津杯法测定五倍子对大黄鱼病原弧菌的体外抑菌活力[J].海洋科学,2009,33(11):44-47.

[14] 张静袆,周曾芬,张喻.大蒜油抑制幽门螺杆菌体外实验研究[J].临床消化病杂志,2006,18(2):108-109.

[15] 林燕文.2种蓼科植物体外抑菌试验研究[J].微生物学杂志，2011,31(3):102-105.

[16] Feng He, Ying Yang , Guang Yang,et al.Studies on antibacterial activity and antibacterial mechanism of a novel polysaccharide fromStreptomycesvirginiaH03[J].Food Control ,2010,21(9):1257-1263

[17] Yi Zhao, Mingshun Chen, Zhengang Zhao,et al.The antibiotic activity and mechanisms of sugarcane (SaccharumofficinarumL.) bagasse extract against food-borne pathogens[J].Food Control ,2015,(185):112-118.

[18] Rinki Dandapat,Bhabani Sankar Jena,Pradeep Singh Negi. Antimutagenic and antibacterial activities ofPeltophorumferrugineumflower extracts[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Disease,2012,2(12): S778-S782.

[19] Sangetha,S Zuraini Z, Suryani S,et al.In situ TEM and SEM studies on the antimicrobial activity and prevention of Candida albicans biofilm by Cassia spectabilis extract[J].Micron,2009,40(4):439-443.

[20] Ann-Li Yong, Keng-Fei Ooh, Hean-Chooi Ong,et al.Investigation of antibacterial mechanism and identification of bacterial protein targets mediated by antibacterial medicinal plant extracts[J].Food Control ,2015,186:32-36.

[21] Lianci Peng, Shuai Kang, Zhongqiong Yin,et al. Antibacterial activity and mechanism of berberine againstStreptococcusagalactiae[J].Int J Clin Exp Pathol ,2015,8(5):5217-5223.

[22] 张丽军.2DE中IPG胶条转移到SDS-PAGE中的技术改进[J].生命科学研究,2004,8(3):225-230.

[23] Luche S,Santoni V,abilloud T. Evaluation of nonionic and zwitteri-onic detergents as membrane protein solubilizers in two-dimensional electrophoresis[J].Proteomics, 2003, 3(3):249- 253.

[24] O′ Farrell P H. High resolution two-dimensional gel electrophoresis of proteins[J]. Journal of Biological Chemistry,1975(10),250:4007-4021.

[25] M T马迪根,J M马丁克.微生物学(第11版)[M].北京:科学出版社,2009:95.

[26] 王倩,谢明杰.木犀草素对金黄色葡萄球菌的抑菌活性及其机制[J].微生物学报,2010,50(9):1180-1184.

[27] 钱丽红,陶妍,谢晶.茶多酚对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌机理[J].微生物学报,2010,37(11): 1628-1633.

[28] Kun Li, Tianyi Jiang, Bo Yu, et al.Transcription Elongation Factor GreA Has Functional Chaperone Activity[J].plos One,2012,7(12):e47521.

[29] 石磊,杨秀艳,赵丽华.超氧化物歧化酶在微生物中的含量及分布情况[J].齐齐哈尔医学院学报,2005,26(7):794-796.

[30] V. Leclère, M. Bèchet,R. Blondeau.Functional significance of a periplasmic Mn-superoxide dismutase fromAeromonashydrophila[J].Journal of Applied Microbiology,2004, 96(4):828-833.

[31] Chuang MH,Wu MS,LoWL,et al.The antioxidant protein alkyl hydroperoxide reductase ofHelicobacterpyloriswitches from a peroxide reductase to a molecular chaperone function[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2006,103(8):2552-2557.

TheAntibacterialActivityandMechanismsofEthanol-ExtractsofRhubarb(Rheumofficinale)againstAeromonashydrophila

ZHOU Liang, XIE Li-ling, ZHU Lin, ZHU Yan-kun, HAN Guang-yao, BI Xiao, PENG Qi

(Coll.ofSci.,ShantouUni.,Shantou515063)

Antibacterial activity and mechanisms of ethanol-extracts of rhubarb (Rheumofficinale) (EER) againstAeromonashydrophilawas studied mainly using Oxford cup and liquid double dilution methods; the antibacterial mechanism of EER was investigated by SEM, SDS-PAGE analysis, two-dimensional electrophoresis and tandem mass spectrometry. The results showed that ethanol-extracts of EER had obvious antibacterial effects, with an inhibition zone diameter of (24.5±0.2) mm. Both the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of EER againstA.hydrophilawere 3.91 mg/mL; Under the action of medicine, the bacterial surface became rough, the cell membrane damaged, and appeared rupture. The content of bacterial protein significantly declined 4 h after treated with medicine (P<0.05), and 2-DE electrophoresis had found three proteins of difference. Therefore, the inhibition mechanism of EER againstA.hydrophilawas to destroy the structure of cell membrane and affect the expression of specific proteins.

rhubarb (Rheumofficinale);Aeromonashydrophila; antibacterial activity; mechanism

汕头大学校内科研基金项目(NFC14003)；广东省自然科学基金项目(S2013010015919)；广东省科技计划项目(2015A020210095)

周亮 男，硕士研究生。研究方向为生物活性物质。E-mail：14lzhou@stu.edu.cn

* 通讯作者。女，硕士，副教授。研究方向为生物活性物质。E-mail：llxie@stu.edu.cn

2016-12-08；

2016-12-21

Q939.96

A

1005-7021(2017)04-0040-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.04.007

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