冬小麦高花药培养力基因型的筛选

赵林姝，刘录祥，古佳玉，谢永盾，郭会君，赵世荣，李军辉，熊宏春

(中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081)

冬小麦高花药培养力基因型的筛选

赵林姝，刘录祥，古佳玉，谢永盾，郭会君，赵世荣，李军辉，熊宏春

(中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081)

为了筛选小麦花培育种骨干亲本，减轻花培育种的基因型依赖性问题，对74个冬小麦品种(系)的5个花药培养力性状进行了鉴定，并对5个性状进行了相关性分析。结果表明，74个基因型的愈伤组织诱导率、绿苗分化率、绿苗产率、白苗分化率及白苗产率变化范围分别为0～43.17%、0～139.29%、0～20.83%、0～63.33%、0～7.17%，各花药培养力性状在所研究基因型中差异明显，存在基因型依赖性，其中绿苗分化率基因型间差异最大。基因型愈伤组织诱导特性与绿苗、白苗的分化正相关，愈伤再生分化成绿苗或是白苗没有相关性。筛选出绿苗产率高于1.0%的基因型22个，其中，SPLM2、衡96851、石4185、邯6172、河农6425五个基因型农艺性状较好，绿苗产率依次为8.17%、5.44%、2.39%、2.00%、0.72%，可作为花培育种的骨干亲本。

小麦；花药培养力；基因型

单倍体是指含有配子体染色体数的个体，经自然或人工加倍后可获得纯合的二倍体植株，应用于育种中可缩短育种年限、提高育种效率。单倍体自然发生频率较低，人工方法诱导是获得单倍体的主要途径[1]。花药离体培养是通过人工途径获得小麦单倍体的主要途径之一，在小麦新品种选育中发挥着重要作用。目前，国内外育种家利用花药离体培养技术已选育出京花1号[2]、AC Andrew[3]、陕农28[4]、H6756[5]、花培8号[6]、生选6号[7]、宁春50号[8]、陇春31号[9]等一批小麦新品种并在生产上应用。

基因型依赖性在一定程度上限制了花药离体培养技术在育种工作中优势潜力的充分发挥[10-11]。研究表明，通过选择高花药培养力小麦基因型作为桥梁亲本组配组合可以减轻育种实践中一些配组绿苗率极低或根本不出绿苗的问题，从而提高小麦花培育种的效率[12-14]。一些研究单位开展了高花药培养力小麦基因型的创制和筛选，例如赵林姝等[15-16]利用诱变及花药培养方法创制出具有高绿苗再生能力的冬小麦基因型H307和SPLM2号等；韩晓峰等[17]通过愈伤组织诱导率的测定，认为石4185及新春9 号小麦品种花药愈伤组织诱导率较高，是开展花药离体培养的适宜基因型。我国冬小麦种植面积和总产量均占常年小麦总面积和总产的90%以上，其中，北方冬麦区(包括北部冬麦区和黄淮冬麦区)小麦面积及总产通常占全国冬麦总量的60%以上，为冬小麦主产区[18]。为减轻北部冬麦区花培育种工作中的基因型依赖问题，本研究对北方冬麦区部分育种单位育成品种(系)的花药培养力性状进行鉴定，筛选出适于该麦区种植的高花药培养力性状基因型，进一步根据农艺性状及配合力分析筛选出优异花培育种亲本，利用优异亲本与生产上主栽品种配制组合并用于花培育种工作，以期提高花培育种的效率。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为74个适于北部及黄淮冬麦区种植的新品种(系)(表1)，现均保存于中国农业科学院作物科学研究所。2011-2012年度将所有供试材料种植于中国农业科学院作物科学研究所试验农场(北京)，每个品种(系)种植1行，按常规方法进行田间管理。

表1 74个基因型的花药培养力Table 1 Anther culture ability of seventy-four genotypes %

(续表1Continuedtable1)

基因型Genotype愈伤组织诱导率Calliper100anthers绿苗分化率Greenplantletsper100calli绿苗产率Greenplantletsper100anthers白苗分化率Albinoplantletsper100calli白苗产率Albinoplantletsper100anthers农大3338Nongda33381．9433．871．0600小偃⁃8154Xiaoyan⁃81541．000000沧麦119Cangmai1190．610000藁城8901Gaocheng89014．949．570．3911．900．56藁优9407Gaoyou94076．6134．953．0600藁优9409Gaoyou94090．78006．670．11邯6172Han61722．67139．292．0000衡96851Heng9685117．8929．855．4438．947．06冀麦37Jimai370．060000师栾02⁃1Shiluan02⁃11．678．330．1700石4185Shi41856．6729．452．391．671．00石家庄15号Shijiazhuang152．220022．221．07石家庄8号Shijiazhuang82．39501．3313．330．39河农6425Henong642510．576．640．7216．131．71刑麦5号Xingmai531．178．712．3923．077．17济麦19Jimai1900000济麦20Jimai203．780000济麦21Jimai211．110000济麦22Jimai220．090000济南17Jinan170．060000莱州953Laizhou9530．568．330．118．330．11烟辐188Yanfu1880．5616．670．1700烟农21Yannong210．7816．670．1700烟农23Yannong230．330000烟优361Yanyou3613．060000德抗961Dekang96116．8317．703．061．720．56鲁原502Luyuan5021．330000泰山008Taishan00800000太原8003Taiyuan80033．396．060．3300西农892513Xinong89251300000西农979Xinong97900000远丰175Yuanfeng1750．220000偃展4110Yanzhan41103．970000偃展99(98)Yanzhan99(98)8．201．400．393．431．17豫麦68Yumai688．0652．003．174．000．28郑麦9023Zhengmai90230．670000郑丰672Zhengfeng67214．720000郑丰6号Zhengfeng60．240000郑麦004Zhengmai00414．174．140．8326．554．67太空6号Taikong61．6116．670．3300郑农18Zhengnong181．060000矮丰66Aifeng660．5011．110．1700矮抗58Aikang588．861．450．135．090．40周麦16Zhoumai165．7814．150．7800周麦18Zhoumai1812．610．670．3313．982．11周麦19Zhoumai196．337．970．5610．091．00兰考13Lankao1318．221．620．221．620．22兰考906Lankao90611．8313．890．8300新麦18Xinmai180．330000新麦19Xinmai192．3322．220．6756．671．33洛旱2号Luohan29．33001．280．11徐541Xu5410．060000

1.2 花药培养

选取花粉粒发育至单核中晚期小麦幼穗，用潮湿的纱布包裹后置于4 ℃冰箱预处理2～3 d。接种前将穗子剥出，用0.1% HgCl2消毒8～10 min，超净台中无菌蒸馏水冲洗3～4次，用镊子取出花药置于诱导培养基上。每个基因型接种18个穗子，每穗选取中部小穗花药进行接种，每3个穗子(100个花药)接种1瓶，每重复200个花药(2瓶)，3次重复。

诱导培养采用C17培养基[19]+2.0 mg·L-12，4-D+0.5 mg·L-1KT+1.5 mg·L-1D-生物素+100.0 mg·L-1Casein Hydrolysate+90 g·L-1蔗糖+5 g·L-1琼脂，pH 5.8。诱导培养采用暗培养，32±1 ℃处理3 d，之后27～29 ℃诱导愈伤。

当愈伤组织直径长至0.5～1.0 mm时转移到分化培养基上，分化培养采用MS培养基[20]+1.0 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT+30 g·L-1蔗糖+5 g·L-1琼脂，pH 5.8。分化培养采用24～26 ℃光培养，每天光照14～16 h，光强2 000 lx。

1.3 花药培养力性状统计与数据分析

愈伤组织诱导率=(产生的愈伤组织块数/接种花药数)×100%；

绿苗分化率=(产生的绿苗数/转分化愈伤数)×100%；

绿苗产率=(产生的绿苗数/接种花药数)×100%；

白苗分化率=(产生的白苗数/转分化愈伤数)×100%；

白苗产率=(产生的白苗数/接种花药数)×100%。

利用EXCEL软件绘制花药培养力性状频次分布图，利用SPSS统计分析软件计算相关系数并进行显著性测验。

2 结果与分析

2.1 不同基因型愈伤组织诱导特性的差异

不同基因型间愈伤组织诱导率差异明显，74个基因型的愈伤组织诱导率分布范围为0～43.17%，平均数为7.7%，中位数为2.53%，其中70个基因型能脱分化出愈伤，但多数基因型愈伤组织诱导率偏低(表1、图1A)。愈伤组织诱导率高于平均数的基因型有25个，其中，高于40%的基因型有2个(中优9701、中麦22)，30%～40%之间的基因型有2个(SPLM2、刑麦5号)，20%～30%之间的基因型有4个(H90265、H60329S、H90096、H90304)，10%～20%之间的基因型有13个(具体见表1)。

图1 74个基因型不同花药培养力性状的频次分布

2.2不同基因型愈伤再生分化花粉植株特性的差异

不同基因型愈伤再生分化绿苗的特性差异明显，74个基因型愈伤绿苗分化率分布范围为0～139.29%，平均数为15.03%，中位数为4.63%，其中，42个基因型的愈伤能分化出绿苗，但多数基因型绿苗分化率偏低(表1、图1B)。绿苗分化率高于平均数的基因型有24个，其中，高于100%的基因型有1个(邯6172)，70%～100%之间的基因型有3个(H60148、H60329S、H261)，60%～70%之间的基因型有1个(S6123)，50%～60%之间的基因型有3个(H60279、豫麦68、石家庄8号)，40%～50%之间的基因型有1个(H60017)，15%～40%之间的基因型有15个(具体见表1)。

不同基因型愈伤再生分化白苗的特性差异明显，74个基因型白苗分化率分布范围为0～63.33%，平均数为6.91%，中位数为0，其中，33个基因型的愈伤再生出了白苗，但多数基因型白苗分化率偏低(表1、图1D)。白苗分化率高于平均数的基因型有19个，其中，白苗分化率高于60%的基因型有1个(H6756)，50%～60%之间的基因型有3个(新麦19、H90304、H90096)，30%～40%之间的基因型有1个(衡96851)，20%～30%之间的基因型有3个(郑麦004、刑麦5号、石家庄15号)，10%～20%之间基因型有9个(具体见表1)。

2.3不同基因型花药经脱分化、分化过程再生花粉植株特性的差异

不同基因型花药分化绿苗能力差异明显，74个基因型绿苗产率分布范围为0～20.83%，平均数为1.71%，中位数为0.17%，多数基因型绿苗产率偏低(表1、图1C)。绿苗产率高于1%的基因型有20个，其中，绿苗产率高于20%的基因型有1个(H60329S)，10%～20%之间的基因型有2个(H60148、H261)，1.71%～10%之间的基因型有17个(具体见表1)。

74个基因型白苗产率分布范围为0～7.17%，平均数为0.77%，中位数为0，多数基因型白苗产率偏低(表1、图1E)。白苗产率高于平均数的基因型有19个，其中，白苗产率高于7%的基因型有2个(刑麦5号、衡96851)，1%～5%之间的基因型有15个(具体见表1)。

2.4 花药培养力性状间的相关性

相关性分析结果(表2)表明，愈伤组织诱导率与绿苗分化率呈显著正相关，与白苗分化率、绿苗产率及白苗产率呈极显著正相关；绿苗分化率与绿苗产率呈极显著正相关，与白苗分化率及白苗产率相关不显著；绿苗产率与白苗产率呈显著正相关，与白苗分化率相关不显著；白苗分化率与白苗产率呈极显著正相关。

2.5 花培育种骨干亲本的农艺性状

本研究通过对适于北部及黄淮冬麦区种植的74个基因型的花药培养力性状的鉴定，筛选出绿苗产率高于1.0%的基因型22个，通过对这些基因型的农艺性状观察，其中，SPLM2、衡96851、石4185、邯6172、河农6425共5个基因型农艺性状较好(表3)，可作为花培育种骨干亲本。

表2 5个花药培养力性状的相关系数Table 2 Correlation coefficients among five traits related to anther culture ability

*和**分别表示在0.05和0.01水平上相关显著。

* and ** mean significant at 0.05 and 0.01 levels, respectively.

表3 5个基因型的农艺性状Table 3 Agronomic traits of five genotypes

3 讨 论

3.1小麦花药培养力性状的基因型依赖性及性状间相关性

花药离体培养再生花粉植株需经过二个阶段，一是花药内的花粉粒由配子体发育途径转变为孢子体发育途径，脱分化形成愈伤组织或胚状体，二是愈伤组织再分化出根和芽，最后形成花粉植株，或胚状体直接再生出花粉植株。衡量小麦基因型花药培养力的5个性状指标中，愈伤组织诱导率表示的是花药离体培养过程第一阶段中花药再生愈伤的能力；绿苗分化率和白苗分化率表示的是花药离体培养过程第二阶段中愈伤或胚状体再生绿苗或白苗的能力；绿苗产率和白苗产率衡量的是花药离体培养过程中第一阶段和第二阶段的综合能力，即花药经过脱分化愈伤(胚状体)过程，最终再生出绿苗或白苗的能力。

研究表明，小麦花药离体培养存在基因型依赖性，花药离体培养的基因型依赖性是限制小麦花培技术广泛应用的主要因素之一。韩晓峰等[17]对11个冬(春)小麦基因型花药愈伤组织诱导特性的研究表明，愈伤组织诱导率差异显著，基因型间分布范围为1.9%～51.9%；王 炜等[21]对86 份甘肃主栽小麦和骨干亲本的愈伤诱导及花粉苗分化情况的研究表明，愈伤组织诱导率、绿苗分化率、绿苗产率及白苗分化率基因型间差异显著，其中，愈伤组织诱导率分布范围为0～88.67%，绿苗分化率分布范围为 0～143.74%，绿苗产率分布范围为0～56.67%，白苗分化率分布范围为0～60.92%。本研究对适于北方冬麦区种植的74个基因型的花药培养力性状鉴定结果表明，愈伤组织诱导率、绿苗分化率、绿苗产率、白苗分化率及白苗产率5个花培性状基因型间均差异明显，与前人研究结果相同。其中，基因型间差异最大的性状是绿苗分化率，其次是白苗分化率、愈伤组织诱导率、绿苗产率、白苗产率。本研究结果与王 炜等[21]研究结果基本一致，基因型间差异最大的花培力性状均为绿苗分化率，基因型间差异均超过100个百分点；由于绿苗产率和白苗产率衡量的是基因型由花药脱分化愈伤(胚状体)及再分化花粉植株的综合能力，因此在所研究花培力性状中差异相对较小。

王 炜等[21]对86份甘肃主栽小麦和骨干亲本花药离体培养的愈伤诱导及绿苗分化情况的相关分析研究表明，愈伤组织诱导率和绿苗分化率没有相关性。本研究对适于北部及黄淮冬麦区种植的74个基因型的花药培养力性状相关性分析表明，愈伤组织诱导率和绿苗分化率呈正相关，此结果与王 炜等[21]研究结果不同，可能是因为所研究基因型不同导致，后续还有待利用更多的基因型进行验证。

3.2 北方冬麦区小麦花培育种骨干亲本的利用

花药离体培养的最终目的是产生尽可能多的绿苗，不产生或尽可能的减少白苗的产生，因此，绿苗产率是评价小麦花药培养力的重要指标。本实验室已利用筛选出的高绿苗率且农艺性状较好的5个花培育种骨干亲本配制了一批组合，特别是在大穗、抗倒、抗病的自育品系SPLM2配制的组合后代中筛选出了一批苗头品系，其中，航麦2566、航麦501、航麦287共3个新品系正在参加国家或省级生产试验，航麦806等4个新品系正在参加省级第二年或第一年区试。

[1]GERMANA M A.Anther culture for haploid and doubled haploid production [J].PlantCellTissueandOrganCulture,2011,104(3):283.

[2] 胡道芬,汤云莲,袁振东,等.冬小麦花粉孢子体的诱导及京花1号的育成[J].中国农业科学,1983(1):29.

HU D F,TANG Y L,YUAN Z D,etal.The induction of pollen sporophyte of winter wheat and the development of the new variety Jinghua 1 [J].ScientiaAgriculturaSinica,1983(1):29.

[3]SADASIVAIAH R S,PERKOVIC S M,PEARSON D C,etal.Registration of 'Deloris' wheat [J].CropScience,2004,44:695.

[4] 王成社,李景琦,邹淑芳,等.小麦新品种陕农28的选育与花培育种技术的改良[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2002,30(40):21.

WANG C S,LI J Q,ZOU S F,etal.Discussion on the improvement of haploid breeding from selecting new varieties of Shaannong 28 [J].JournalofNorthwestAgricultureandForestryUniversity(NaturalScienceEdition),2002,30(40):21.

[5]LIU L X,ZHAO L S,GUO H J,etal.A salt tolerant mutant wheat cultivar ‘H6756’ [J].PlantMutationReports,2007(1):50.

[6]KANG M H,HAI Y,HUANG B Y,etal.Breeding of newly licensed wheat variety Huapei 8 and improved breeding strategy by anther culture [J].AfricanJournalofBiotechnology,2011,10:19701.

[7] 姚金保,陆维忠.小麦新品种生选6号的丰产稳产性和赤霉病抗性分析[J].麦类作物学报,2012,32(4):793.

YAO J B,LU W Z.Analysis of yield potential,yield stability and resistance to Fusarium head blight of new wheat cultivar Shengxuan 6 [J].JournalofTriticeaeCrops,2012,32(4):793.

[8] 魏亦勤,叶兴国,李红霞,等.高产优质春小麦新品种宁春50号[J].麦类作物学报,2012,32(2):38.

WEI Y Q,YE X G,LI H X,etal.A high yield and good quality spring wheat variety Ningchun 50 [J].JournalofTriticeaeCrops,2012,32(2):38.

[9] 王 炜,杨随庄,叶春雷,等.丰产优质花培春小麦新品种-陇春31号[J].麦类作物学报,2014,34(3):432.

WANG W,YANG S Z,YE C L,etal.A high yield and good quality spring wheat variety Longchun 31 of anther culture method [J].JournalofTriticeaeCrops,2014,34(3):432.

[10]BROUGHTON S.Ovary co-culture improves embryo and green plant production in anther culture of Australian spring wheat(TriticumaestivumL.) [J].PlantCellTissueandOrganCulture,2008,95:190.

[11]LANTOS C,WEYEN J,ORSINI J M,etal.Efficient application ofinvitroanther culture for different European winter wheat(TriticumaestivumL.) breeding programmes [J].PlantBreeding,2013,132:149.

[12]TUVESSON S,LJUNGBERG A,JOHANSSON N,etal.Large-scale production of wheat and triticale double haploids through the use of a single-anther culture method [J].PlantBreeding,2000,119:458.

[13] 张艳敏,郭北海,李洪杰,等.小麦花药培养的基因型差异与杂交组合配制[J].华北农学报,2002,17(2):18.

ZHANG Y M,GUO B H,LI H J,etal.Genotype difference in wheat anther culture response and selection of cross combination [J].ActaAgriculturaeBoreali-Sinica,2002,17(2):18.

[14]YILDIRIM M,BAHAR B,GENC I.Reciprocal effects in anther cultures of wheat hybrids [J].BiologiaPlantarum,2008,52(4):781.

[15]ZHAO L S,LIU L X,WANG J,etal.Development of a new wheat germplasm with high anther culture ability by using a combination of gamma-ray irradiation and anther culture [J].JournaloftheScienceofFoodandAgriculture,2015,95:122.

[16] 赵林姝,刘录祥,郭会君,等.三个高花药培养力小麦材料培养力性状的配合力分析[J].麦类作物学报,2012,32(3):427.

ZHAO L S,LIU L X,GUO H J,etal.Combining ability analysis on anther culture traits of three wheat genotypes with high regeneration ability [J].JournalofTriticeaeCrops,2012,32(3):427.

[17] 韩晓峰,陶丽莉,殷桂香,等.基因型和环境条件对小麦花药培养效果的影响[J].作物学报,2010,36(7):1209.

HAN X F,TAO L L,YIN G X,etal.Effect of genotype and growing environment on anther culture in wheat [J].ScientiaAgriculturaSinica,2010,36(7):1209.

[18] 赵广才.中国小麦种植区划研究(一)[J].麦类作物学报,2010,30(5):888.

ZHAO G C.Study on Chinese wheat planting regionalization(Ⅰ) [J].JournalofTriticeaeCrops,2010,30(5):888.

[19] 王 培,陈玉蓉.C17培养基在花药培养中应用的研究[J].植物学报,1986,28(1):38.

WANG P,CHEN Y R.A study on the application of C17medium for anther culture [J].ActaBotanicaSinica,1986,28(1):38.

[20]MURASHIGE T,SKOOG F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures [J].PhysiologiaPlantarum,1962,15:478.

[21] 王 炜,陈 琛,叶春雷,等.甘肃主栽小麦品种及骨干亲本花药培养特性评价及分析[J].核农学报,2016,30(6):1061.

WANG W,CHEN S,YE C L,etal.Evaluation and analysis of anther culture characteristics in Gansu wheat cultivars and backbone parents [J].JournalofNuclearAgriculturalSciences,2016,30(6):1061.

ScreeningofWinterWheatGermplasmswithHighAntherCultureAbility

ZHAOLinshu,LIULuxiang,GUJiayu,XIEYongdun,GUOHuijun,ZHAOShirong,LIJunhui,XIONGHongchun,

(Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081, China)

In order to screen the genotype with good anther culture response and agronomic traits, and decrease the genotype dependence, we characterized five anther-culture associated traits for 74 winter wheat varieties (lines) and conducted correlation analysis on these traits. The results showed that the variation range of the proportion of calli per 100 anthers, green plantlets per 100 calli, green plantlets per 100 anthers, albino plantlets per 100 calli and albino plantlets per 100 anthers was 0-43.17%, 0-139.29%, 0-20.83%, 0-63.33%, and 0-7.17%, respectively. All the five traits showed great genotype dependence, among which, the proportion of green plantlets per 100 calli displayed greatest genotype dependence. Correlation analysis results indicated that there was positive correlation between callus induction capacity of each genotype and green- and albino-seedlings differentiation. It did not show any correlation whether callus would differentiate to green seedlings or albino seedlings. In this study, the proportion of green plantlets per 100 anthers of 22 genotypes screened was higher than 1%. Five of these 22 genotypes, such as SPLM2, Heng 96851, Shi 4185, Han 6172, and Henong 6425, are suggested to serve as backbone parents for anther culture based breeding approach, as they have good agronomic traits.

Wheat; Anther culture ability; Genotype

时间：2017-10-11

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20171011.1601.006.html

2017-03-10

2017-07-31

“十三五”国家重点研发计划项目(2016YFD0102101)；中国农业科学院作物科学研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项

E-mail：zhaolinshu@caas.cn

刘录祥(E-mail:liuluxiang@caas.cn)

S512.1；S330

A

1009-1041(2017)10-1294-07