柱花草花药离体培养研究

单国燕等

摘 要 以热研2号柱花草花药为外植体，研究不同植物生长调节剂 、培养基以及低温预处理等对柱花草花药培养的影响，以期建立柱花草花药培养体系，获得再生植株，为柱花草倍性、基因组学及分子生物学研究提供材料。关键词 柱花草 ；花药培养 ；愈伤组织诱导 ；不定芽分化

分类号 S541.04

In Vitro Anther Culture of Stylosanthes

SHAN Guoyan1，2） ZHENG Jinlong1，2） GAO Jianming1，2，3）

CHEN Helong1，2，3） ZHANG Shiqing1，2，3） YI Kexian1，2）

（1 Environment and Plant Protection Institute，CATASs，Haikou，Hainan 571101，P.R. China；

2 Ministry of Agriculture Key Laboratory of Tropical Crop Biotechnology， Haikou， Hainan 571101；

3 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，CATAS，Haikou，Hainan 571101，P.R. China）

Abstract In order to establish an efficient anther culture system of Stylosanthes， get regenerate plantlet and provide basic materials for the research of ploidy， genomics and molecular biology of Stylosanthes. This experiment taking the anther of Stylosanthes guianensis cv， Reyan2 as explants to study the effect of plant growth regulator， medium and low temperature pretreatment on Stylosanthes anther culture. The results indicated that low temperature pretreatment for 24 h was better than other treatments. N6 medium supplemented with 2，4-D 0.5 mg/L，KT 1.0 mg/L was the best for induction of cullus. MS +NAA 0.2 mg/L + 6-BA 3.0 mg/L was the best for regeneration culture.

Keywords Stylosanthes ； anther culture ； callus induction ； division of adventitious bud

柱花草（Stylosanthes spp.）又名笔花豆，是全球热带地区栽培面积最大、应用最广泛的优良豆科牧草。柱花草原产于南美洲，该属有44个以上的种或亚种[1]。柱花草炭疽病是威胁其推广种植的主要障碍，近年来国内外在柱花草种质资源的收集、引种选育，从体细胞变异或体细胞融合技术中获得抗炭疽病植株以及利用遗传工程获得抗病转基因植株等方面展开了多项研究[2-6]。国外在20世纪60年代就开展了柱花草的组织培养研究[7-8]，但由于所使用的基因型有限，成效不显著。随着遗传工程技术的日益成熟，通过该技术培育更多优良的柱花草品种希望较大。同科柱花草不同品种的组织培养技术国内外已有成功的报道[9-13]。但是目前关于柱花草花药培养研究尚未见报道。

花药培养作为一种新的育种手段，在很多作物育种中得到应用。通过花药培养可诱导花粉发育形成单倍体，快速获得纯系，缩短育种周期，还有利于诱导花药形成隐型突变体，提高选择效率。所诱导出的单倍体仅有一套染色体，它具有特殊的遗传学特征：（1）遗传的（染色体的）稳定性和变异性；（2）小孢子无性系变异；（3）遗传基因型在纯合的植株水平上充分表达。所以，不仅是研究遗传、变异、重组和表达等遗传学问题的一个理想体系[14]，通过它还可以迅速得到DH 群体、克服远缘杂交不育性、提高育种效率。本试验主要研究影响柱花草花药培养的因素，旨在建立柱花草花药培养技术体系，为今后开展柱花草遗传育种研究积累资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

材料为‘热研2号柱花草的花药，取自中国热带农业科学院热带牧草研究中心。

1.1.2 试验用品

2 结果与分析

2.1 愈伤组织的诱导

2.1.1 愈伤组织形成

柱花草花药离体培养1周左右开始膨大，部分花药颜色由黄色变淡黄色至黄褐色，个别花药出现晶状小水珠。2周左右某些花药颜色发亮，经过1～2 d，发亮的花药逐渐开裂，并从缢痕处生出小白点，逐渐扩大体积，颜色由白变淡黄或黄绿色，这就是愈伤组织。大多数在20 d左右形成愈伤组织，刚开始愈伤组织生长缓慢，但以后逐渐加快，接种20～30 d为愈伤增殖高峰期，35 d后逐渐有褐化现象出现。愈伤组织的形态大致可以分为2种，一种是质地疏松的白色组织，另一种是质地致密的黄绿色组织，有紧实型和疏松型，紧实型中又分表面光滑和不光滑2种。前者颜色较深，在培养过程中慢慢老化死亡，或不分化；后者生长旺盛，分裂能力强，分化成苗的潜力大。故紧实表面不光滑、黄绿色的愈伤组织，具有分化成带有绿色芽点和植株的能力。endprint

2.1.2 不同基本培养基对柱花草花药愈伤组织诱导的效应

培养基类型对花药愈伤组织的诱导率有明显影响，花药在不同培养基上的长势也不同（表2）。在2种基本培养基比较试验种，以N6培养基的愈伤组织诱导率最高，MS次之。同时，N6培养基上的愈伤组织发生时间最早，愈伤组织直径也大于MS培养基所诱导的愈伤组织。N6培养基对柱花草花药愈伤组织诱导的效果优于MS培养基。试验说明，不同基本培养基对诱导柱花草花药愈伤差异较大。以N6培养基最适合柱花草花药愈伤诱导。

2.1.3 培养基及附加成分对愈伤组织形成的影响

柱花草花药接种于12种培养基上（表3），2.3 生根培养

在分化培养基中的苗长到4～5 cm的时候，将丛生芽由愈伤组织上切下，在无菌条件下分成细小的单株和健壮的单株，分别转接到生根培养基M13和M14中。转接后约过10 d开始生根，生根率均可达90%以上。

3 讨论与结论

（1） 低温预处理对柱花草花药培养的影响

有研究认为，低温预处理的作用是能够提供一个更适合的环境，以利于愈伤组织诱导和诱导期花药存活。接种前的低温处理有利于提高花药培养效率，但确切的机制尚不清楚，可能与一种分子量为32 ku的蛋白质有关[16]。自Nitsch等[17]于1973年首次发现低温预处理可提高毛叶曼陀罗花药培养中胚状体的形成以来，水稻、小麦、大麦等多种作物的花药培养用低温预处理后均可不同程度地提高花粉愈伤组织或花粉胚状体的诱导频率[18-20]。本试验中，分别对柱花草花药进行4℃低温预处理24、48、72 h，其愈伤组织诱导率均高于对照，在这一点上，与大多数植物的花药培养相似。

（2） 基本培养基对柱花草花药愈伤组织诱导的影响

培养基是植物组织培养的物质基础。选择不同的基本培养基，对柱花草花药愈伤组织诱导有着明显的影响，因此有人研制专门的培养基及其附加物，如针对烟草花培的H和T培养基[21]。本实验选取MS、N6两种培养基对花药诱导进行比较，结果表明，MS培养基的诱导率最高，愈伤组织发生时间最早，而且愈伤组织在继代培养过程中色泽、质地均优于N6培养基。因此，在进行柱花草花药培养时，可选择MS培养基作为基本培养基，以提高花药培养效率。

（3） 激素处理对柱花草花药培养愈伤组织诱导的影响

在培养基中加入不同的激素种类及浓度，对柱花草花药愈伤组织的诱导有不同的影响。培养基中激素的种类、用量和配比，对诱发小孢子启动、分裂、生长和分化起决定性作用，一般低浓度的生长素类物质可提高胚状体的诱导率[22]。有研究[23]表明，愈伤组织的诱导形成，生长素是必需的，其中2，4-D应用较多，附加一定浓度的细胞分裂素效果可能更好。本试验结果表明：在柱花草花药培养中，2，4-D对愈伤组织的形成是必不可少的，并且2，4-D与KT配合使用比单独使用KT、6-BA的诱导效果好。不同激素配比对柱花草花药培养的效果有待进一步研究。

柱花草花药培养是获得无毒苗的途径之一，其优点是脱毒率高、安全可靠。在提高花药培养诱导率的基础上，将花药培养技术与细胞离体筛选、诱变、转基因技术相结合，可在短时间内培育出柱花草新品种。特别是以花药培养单倍体愈伤组织或植株作为转化受体，可以实现外源基因的稳定转化，在柱花草转化研究中具有广泛应用前景。

参考文献

[1] Tacket C O， Mason H S， Losonsky G， et al. Immunogenicity in humans of are combinant bacterial antigen delivered in a transgenic potato[J]. Nat Med， 1998（4）：607-609.

[2] Ehssani P. Khabiri A，Domansky N N. Polypeptides of hepatitis B surface antigen in transgenic plants [J]. Proc N atl Acad Sci USA， 1997， 190： 107-111.

[3] Rodrigo S. Agrobacterium-mediated transformation of Stylosanthes guianesis and production of transgenic planta [J]. Plant Science， 1994， 96：119-127.

[4] 冯淑芬，李凤娥，何朝族，等. 笔花豆炭疽病菌生物学特性和流行条件研究[J]. 热带作物研究，1994（1）：87-94.

[5] 将候明，何朝族，李居正，等. 热带优良豆科牧草——热研2号柱花草的选育和推广[J]. 热带作物研究，1992（1）：62-66.

[6] 梁英彩，赖志强，腾少花，等. 907柱花草的选育研究[J]. 草业科学，1998，15（2）：27-30.

[7] Clements R J. Pasture for prosperity 3 the future for new tropical pasture plants[J]. Tropical Grasslands， 1996， 30： 31-36.

[8] Edye L A， Mass B L. Recent advances in studies of an tyracnose of Stylosanthes[J]. Trop Grass， 1997， 31： 417-423.

[9] 将昌顺，黄慧德，邹冬梅，等. 热研二号柱花草组织培养研究[J]. 草地学报，1998，6（1）：33-37.endprint

[10] Meiger E G M， Broughton W J. Regeneration of whole from hypocotyls-， root- and leaf-derived tissue culture of the pasture Stylosanthes guyanensis[J]. Physiologia Plantatarum， 1981， 52： 280-284.

[11] Meiger E G M. High-frequency plant regeneration from hypocotyls， and leaf-derived tissue cultures of the tropical Stylosanthes guyanensis[J]. Physiologia Plantatarum， 1982， 56： 381-385.

[12] Meiger E G M， Steinbis H H. Plantlet regeneration from suspension and protoplast cultures of the tropical Stylosanthes guyanensis（Aubl）[J]. Annals of Botany， 1983， 52： 305-310.

[13] Mroginski L A， Kartha K K. Regeneration of plants from callus tissue of the forages legume Stylosanthes guyanensis[J]. Plant Science Letter，1981， 23： 245-251.

[14] 胡 含. 离体诱导单倍体在植物遗传与育种中的应用[J]. 科技前沿与学术，2001，21（2）：41-44.

[15] 何定钢，欧阳俊闻. 小麦不同发育时期花药对离体培养的反应[J]. 植物学报，1984（6）：14-16.

[16] Genvesi A D. Maize（Zea mays L.）：In vitro production of hap loids[M]. In：BajajY P S（eds）. Biotechnology in Agriculture and Forestry： Haploids in Crop Improvement. Berlin：Springer-Verlag， 1990.

[17] Nitsch C， Norreel B. Effet d'un choe thermique sur le pouviur embryogene du pollen de pollen de Datura innoxia cultive dans I'anthere ou isole de L'anthere[J]. C R Acad Sci， 197 276（Serie D）：3 03-306

[18] 王敬驹，孙敬三，朱自清. 水稻花粉植株的诱导及影响诱导频率的某些因素[J]. 植物学报，1974，16（1）：43-53

[19] 潘景丽，白守信，管启良，等. 影响小麦（Triticum vulgare）花粉植株诱导频率的几种因素[J]. 植物学报，1973，17（2）：161-166

[20] 黄 斌. 大麦花药培养中低温预处理对花粉愈伤组织形成的影响[J]. 植物学报，1985，27（3）：430-443

[21] 王玉英，高新一. 植物组织培养技术手册[M]. 北京：金盾出版社，2006.

[22] 曹华兴，顾永强，何小华. 激素在西瓜组织培养中对不定芽发生的影响[J]. 上海农学院学报，1986，4（4） ：280-283.

[23] 刘敦菊，张 霞，王 晶. 杜鹃红山茶花药愈伤组织的诱导[J]. 西南师范大学学报：自然科学版，2011，36（3）：128-131.endprint

[10] Meiger E G M， Broughton W J. Regeneration of whole from hypocotyls-， root- and leaf-derived tissue culture of the pasture Stylosanthes guyanensis[J]. Physiologia Plantatarum， 1981， 52： 280-284.

[11] Meiger E G M. High-frequency plant regeneration from hypocotyls， and leaf-derived tissue cultures of the tropical Stylosanthes guyanensis[J]. Physiologia Plantatarum， 1982， 56： 381-385.

[12] Meiger E G M， Steinbis H H. Plantlet regeneration from suspension and protoplast cultures of the tropical Stylosanthes guyanensis（Aubl）[J]. Annals of Botany， 1983， 52： 305-310.

[13] Mroginski L A， Kartha K K. Regeneration of plants from callus tissue of the forages legume Stylosanthes guyanensis[J]. Plant Science Letter，1981， 23： 245-251.

[14] 胡 含. 离体诱导单倍体在植物遗传与育种中的应用[J]. 科技前沿与学术，2001，21（2）：41-44.

[15] 何定钢，欧阳俊闻. 小麦不同发育时期花药对离体培养的反应[J]. 植物学报，1984（6）：14-16.

[16] Genvesi A D. Maize（Zea mays L.）：In vitro production of hap loids[M]. In：BajajY P S（eds）. Biotechnology in Agriculture and Forestry： Haploids in Crop Improvement. Berlin：Springer-Verlag， 1990.

[17] Nitsch C， Norreel B. Effet d'un choe thermique sur le pouviur embryogene du pollen de pollen de Datura innoxia cultive dans I'anthere ou isole de L'anthere[J]. C R Acad Sci， 197 276（Serie D）：3 03-306

[18] 王敬驹，孙敬三，朱自清. 水稻花粉植株的诱导及影响诱导频率的某些因素[J]. 植物学报，1974，16（1）：43-53

[19] 潘景丽，白守信，管启良，等. 影响小麦（Triticum vulgare）花粉植株诱导频率的几种因素[J]. 植物学报，1973，17（2）：161-166

[20] 黄 斌. 大麦花药培养中低温预处理对花粉愈伤组织形成的影响[J]. 植物学报，1985，27（3）：430-443

[21] 王玉英，高新一. 植物组织培养技术手册[M]. 北京：金盾出版社，2006.

[22] 曹华兴，顾永强，何小华. 激素在西瓜组织培养中对不定芽发生的影响[J]. 上海农学院学报，1986，4（4） ：280-283.

[23] 刘敦菊，张 霞，王 晶. 杜鹃红山茶花药愈伤组织的诱导[J]. 西南师范大学学报：自然科学版，2011，36（3）：128-131.endprint

[10] Meiger E G M， Broughton W J. Regeneration of whole from hypocotyls-， root- and leaf-derived tissue culture of the pasture Stylosanthes guyanensis[J]. Physiologia Plantatarum， 1981， 52： 280-284.

[11] Meiger E G M. High-frequency plant regeneration from hypocotyls， and leaf-derived tissue cultures of the tropical Stylosanthes guyanensis[J]. Physiologia Plantatarum， 1982， 56： 381-385.

[12] Meiger E G M， Steinbis H H. Plantlet regeneration from suspension and protoplast cultures of the tropical Stylosanthes guyanensis（Aubl）[J]. Annals of Botany， 1983， 52： 305-310.

[13] Mroginski L A， Kartha K K. Regeneration of plants from callus tissue of the forages legume Stylosanthes guyanensis[J]. Plant Science Letter，1981， 23： 245-251.

[14] 胡 含. 离体诱导单倍体在植物遗传与育种中的应用[J]. 科技前沿与学术，2001，21（2）：41-44.

[15] 何定钢，欧阳俊闻. 小麦不同发育时期花药对离体培养的反应[J]. 植物学报，1984（6）：14-16.

[16] Genvesi A D. Maize（Zea mays L.）：In vitro production of hap loids[M]. In：BajajY P S（eds）. Biotechnology in Agriculture and Forestry： Haploids in Crop Improvement. Berlin：Springer-Verlag， 1990.

[17] Nitsch C， Norreel B. Effet d'un choe thermique sur le pouviur embryogene du pollen de pollen de Datura innoxia cultive dans I'anthere ou isole de L'anthere[J]. C R Acad Sci， 197 276（Serie D）：3 03-306

[18] 王敬驹，孙敬三，朱自清. 水稻花粉植株的诱导及影响诱导频率的某些因素[J]. 植物学报，1974，16（1）：43-53

[19] 潘景丽，白守信，管启良，等. 影响小麦（Triticum vulgare）花粉植株诱导频率的几种因素[J]. 植物学报，1973，17（2）：161-166

[20] 黄 斌. 大麦花药培养中低温预处理对花粉愈伤组织形成的影响[J]. 植物学报，1985，27（3）：430-443

[21] 王玉英，高新一. 植物组织培养技术手册[M]. 北京：金盾出版社，2006.

[22] 曹华兴，顾永强，何小华. 激素在西瓜组织培养中对不定芽发生的影响[J]. 上海农学院学报，1986，4（4） ：280-283.

[23] 刘敦菊，张 霞，王 晶. 杜鹃红山茶花药愈伤组织的诱导[J]. 西南师范大学学报：自然科学版，2011，36（3）：128-131.endprint