薏苡仁醇溶蛋白源小分子肽生物学活性研究

李玲玲，李开，张月圆，陈佩瑶，王灵芝

(北京中医药大学中药学院，北京 100102)

薏苡仁醇溶蛋白源小分子肽生物学活性研究

李玲玲，李开，张月圆，陈佩瑶，王灵芝*

(北京中医药大学中药学院，北京 100102)

目的：探究体外酶解条件下，薏苡仁醇溶蛋白源小分子肽(Coixprolamin peptide，CPP)在降压及免疫方面的生物活性。方法：模拟胃肠环境水解薏苡仁醇溶蛋白，超滤法获得小分子肽，测定其体内外降压作用；MTT法评价其对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。结果：终浓度0.1 mg/mL时，醇溶蛋白胃蛋白酶4 h水解物对血管紧张素转化酶(ACE)的抑制率显著高于其他混合酶水解产物，延长水解时间至48 h，产物ACE抑制率及蛋白水解度均显著提高。单次灌胃(125～500 mg/kg)CPP，可显著降低SHR血压。5～160 μg/mLCPP可显著促进正常小鼠脾淋巴细胞体外增殖。结论：薏苡仁醇溶蛋白经模拟胃肠环境水解后可产生具有显著体内外降压作用的CPP，且CPP可促进小鼠脾脏淋巴细胞增殖，影响机体免疫功能。

薏苡仁；醇溶蛋白；生物肽；降压；免疫

薏苡仁(Coixlachryma-jobiL.var.mayuen Stapf)，又名薏米、菩提子、六各米等，性微寒，味甘、淡，归脾、胃、肺经，有健脾渗湿，除痹止泻，清热排脓等功效[1]。现代研究表明，薏苡仁具有广泛的药理活性[2-4]，在抗肿瘤、抗炎、抗菌、免疫增强、降脂、降糖及降压等方面发挥重要作用。

天然来源的蛋白质通过酶解可释放具有多种功能的生物肽，如降压肽[5]、抗氧化肽[6]、抗肿瘤肽[7]和抗菌肽[8]等。生物肽因来源简单方便，适应证广、安全性高且疗效显著而倍受关注[9]。本课题组前期工作表明薏苡仁醇溶蛋白含量高[10]，其酶解物具有明确的ACE抑制活性[11]。本研究以薏苡仁醇溶蛋白为材料，模拟胃肠消化环境水解醇溶蛋白以获得小分子生物肽，并探究其在降压及免疫调节方面的生物学活性。

1 材料

1.1 药材

薏苡仁购自北京同仁堂药店，批号:20150311，产地福建，经北京中医药大学刘春生教授鉴定为禾本科植物薏苡的干燥成熟种仁。

1.2 动物

自发性高血压大鼠(SHR)，9周龄，雄性，SPF级，许可证号:SCXK(京)2015-0001，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

BALB/c，7周龄，雌性，SPF级，许可证号:SCXK(京)2016-0002，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司。

1.3 试剂

胃蛋白酶(批号:01535535)、胰蛋白酶(批号:1001963427)、α-糜蛋白酶(批号:101170575)、马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL，批号:1001510772)、马尿酸(HA，批号:112003)及血管紧张素转化酶(ACE，批号:1001926470)，购自美国Sigma公司；卡托普利(批号:100318-200602)，中国药品生物制品检定所；刀豆蛋白A(Con-A)、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)，购自北京拜尔迪生物公司；胎牛血清(FBS)、RPMI-1640培养基，购自北京华奥正生科技有限公司。邻苯二甲醛(OPA)试剂及硼酸缓冲液的配制参考袁建娜[9]等报道的方法。其它试剂均为分析纯。

1.4 仪器

Neofuge 23R型台式高速冷冻离心机(力康发展有限公司)，CPA225D型电子分析天平(1/10万，德国Sartorius公司)，PHS-3C型pH计(上海佑科仪器仪表有限公司)，ETS-D5磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)，Multiskan GO全波长酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)，UNIC UV-2000紫外分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司)，Waters高效液相色谱仪(美国Waters公司)，BP-98A型大鼠无创血压测试仪(北京软隆生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 薏苡仁醇溶蛋白提取

采用顺序抽提法[12]提取薏苡仁醇溶蛋白。薏苡仁药材粉碎，过40目筛，石油醚脱脂，真空干燥，薏苡仁粉末分别经ddH2O、0.5%NaCl抽提弃除清蛋白和球蛋白后，70%乙醇(含5%巯基乙醇、0.5% NaAC)于室温振荡抽提30 min，10 000 r/min离心15 min，重复2次，合并上清液即为醇溶蛋白，低温透析24 h，冷冻干燥。

2.2 薏苡仁醇溶蛋白纯度测定

凯氏定氮法[13]测定醇溶蛋白冻干粉中蛋白质含量。精确称取一定量的样品，置于凯氏烧瓶中，依次加入催化剂(CuSO4、K2SO4)和浓硫酸，缓慢加热至消化终点，消化液定容后蒸馏，0.005 mol/L稀硫酸滴定，根据酸消耗量计算样品中的蛋白含量。

Vx为样品消耗酸滴定液的体积(mL)，V0为空白消耗酸滴定液的体积(mL)，0.140 1为消耗1 mL酸滴定液相当于0.140 1 mg氮，6.25为1 g氮相当于6.25 g蛋白质，C为称量样品的质量(mg)。

2.3 薏苡仁醇溶蛋白模拟消化道酶解

醇溶蛋白的模拟胃肠水解反应，参照刘先国[14]和Zhao[15]等，并略有改进。

2.3.1 模拟胃液消化

准确称取醇溶蛋白冻干粉，按照底物浓度1%(w/v)，胃蛋白酶与底物比1∶10(w/w)溶于pH2.0的HCl溶液中，37℃恒温水浴4 h。

2.3.2 模拟肠道消化

底物浓度1%(w/v)，胰蛋白酶与底物比1∶500(w/w)，α-糜蛋白酶与底物比3∶500(w/w)溶于pH 7.8的NaOH溶液中，37℃恒温水浴3 h。

2.3.3 模拟胃肠连续消化

胃液消化条件同2.3.1，37℃消化4 h后，用0.09 mol/L NaHCO3溶液调pH值至5.3，再用1 mol/L NaOH溶液将其pH值调至7.8，加入胰蛋白酶(E：S=1∶500，w/w)和α-糜蛋白酶(E：S=3∶500，w/w)，37℃继续消化3 h。

2.3.4 胃蛋白酶长时间酶解

准确称取醇溶蛋白冻干粉，按照底物浓度1%(w/v)，胃蛋白酶与底物比1∶10(w/w)溶于pH 2.0的HCl溶液中，37℃恒温水浴48 h。

反应结束后，酶解液95℃水浴5 min终止反应，冰浴10 min，4℃，10 000 r/min离心20 min，将上清液转入截留分子量为3 kDa的超滤管中离心，收集各滤过液，冷冻干燥后的不同酶解方式下的薏苡仁醇溶蛋白源小分子肽(CPP)。

2.4 薏苡仁醇溶蛋白水解度测定

OPA法[16]测定薏苡仁醇溶蛋白水解度(Degree of hydrolysis,DH)。取200 μL不同时间胃蛋白酶解液与1.5 mLOPA试剂混合，精确反应2 min，于340 nm测定吸光度值(A)。以0.951 6 mmol/L丝氨酸标准液作为阳性对照，去离子水为空白对照。计算公式如下：

X为样品质量(g)，P为样品中蛋白质含量(%)，α、β和htot为常数(α=1.0，β=0.4，htot=8.0)。

2.5 ACE抑制活性测定

高效液相色谱法(HPLC)[17]测定CPP体外ACE抑制活性。将样品溶于0.1 mol/L硼酸缓冲液至浓度为0.5 mg/mL。反应体系50 μL，其中样品溶液10 μL、ACE 20 μL(2 mU)，底物 HHL 20 μL，37℃温浴60 min，加入100 μL乙腈终止反应，10 000 r/min离心20 min，测定样品中马尿酸(HA)的含量。卡托普利(1×10-7mol/L)为阳性对照，硼酸缓冲液为阴性对照。

样品经C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，TIANHE)进行分析，流动相A为H2O(含0.05% TFA，V/V)，流动相B为100%乙腈，洗脱条件为A∶B=75∶25，流速1 mL/min，柱温30℃，上样量10 μL，检测波长228 nm。ACE抑制率计算公式如下：

A为样品参与反应的条件下所产生的HA峰面积，B为空白对照所产生的HA峰面积。

2.6 SHR体内降压效果评价

大量制备薏苡仁醇溶蛋白的胃蛋白酶48 h水解所得CPP，灌胃给药方式进行体内降压活性评价。

选取尾收缩压(SBP)高于180 mmHg的雄性SHR30只，预饲养一周。将大鼠随机分为5组，即空白对照组(生理盐水，5 mL/kg)、卡托普利组(17.5 mg/kg)、低剂量组(125 mg/kgCPP)、中剂量组(250 mg/kgCPP)与高剂量组(500 mg/kgCPP)。尾袖法测定灌胃给药前(0 h)和给药后(2、4、6、8、10、12 h)各组SHR的SBP。

2.7 小鼠脾细胞增殖率测定

MTT法测定胃蛋白酶48 h CPP对小鼠脾淋巴细胞增殖的作用[18]。

小鼠脱颈处死，75%酒精浸泡5 min，无菌剥离脾脏，置于RPMI1640培养液中，剪碎并轻轻研磨，过200目细胞筛，收集细胞液于离心管，4℃，1 000 r/min，离心5 min，弃上清，破除红细胞后，调整细胞浓度至2.4×10-6个/mL。

于96孔细胞培养板上加入100 μL/孔细胞悬液，分别加入不同浓度的CPP(终浓度分别为5,10,20,40,80,160 μg/mL)，阳性对照为Con-A(终浓度10 μg/mL)，终体积为150 μL/孔。培养板置5%CO2、37℃培养68 h后，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，继续培养4 h，2 500 r/min，离心10 min，弃上清，每孔加入150 μL DMSO溶液充分振荡溶解，570 nm处测定吸光度值，计算增殖率(ProliferationRate,PR),

AT为实验组的吸光度值，AB为空白对照组的吸光度值。

2.8 统计学分析

3 结果

3.1 薏苡仁醇溶蛋白纯度

采用凯氏定氮法对所称取薏苡仁醇溶蛋白粉末进行蛋白定量，经测定样品中蛋白含量为(75.35±0.21)%，表明此方法醇溶蛋白提取效率较高。

3.2 薏苡仁醇溶蛋白模拟胃肠道消化产物体外ACE活性

HPLC法测定不同酶解方式下获得的CPP体外ACE抑制活性结果见表1。对照品HA(图1A)和HHL(图1B)的出峰时间分别为5.5和9.2 min。阳性对照卡托普利在终浓度为2×10-8mol/L时，ACE抑制率为(85.68±0.12)%(图1C)。薏苡仁醇溶蛋白经模拟胃肠消化后获得的CPP在终浓度为0.1 mg/mL时均表现出不同程度的ACE抑制活性。其中胃蛋白酶单独消化4h获得CPP的ACE抑制率为(62.71±0.45)%(图1D)，显著高于胰蛋白酶和糜蛋白酶混合酶水解所获CPP(P<0.05)。模拟胃肠连续消化所获得CPP体外ACEI活性低于单独胃液消化产物，且差异具有统计学意义(P<0.05)。此外，胃蛋白酶水解48 h获得的CPP表现出最高的体外ACE抑制活性，其抑制率达到(70.25±0.33)%(图1H)，显著高于其它水解方式所获生物肽(P<0.05)。

表1 不同酶解条件下小分子肽体外ACE抑制活性

注：不同酶解条件下，ACE抑制率差异显著(P<0.05)。卡托普利终浓度2×10-8mol/L；其他样品终浓度0.1 mg/mL

图1 不同样品的HPLC图 注：A.HA对照品；B.HHL对照品；C.空白对照；D.卡托普利；E.胃酶解物；F.肠酶解物；G.连续酶解物；H.长时间酶解物。(A=228 nm)卡托普利终浓度2×10-8 mol/L；其他样品终浓度0.1 mg/mL。

3.3 醇溶蛋白水解度(DH)的测定

薏苡仁醇溶蛋白在胃蛋白酶作用下的水解度变化趋势如图2所示，随着时间的延长，水解度呈上升趋势，在4～12 h内，，DH由(8.44±0.22)%提高到(12.10±0.31)%；之后DH变化趋向平缓，48 h时，醇溶蛋白DH可达(15.93±0.15)%，显著高于其它时间点(P<0.05)。由于薏苡仁醇溶蛋白48h酶解物的体外ACE抑制率及水解度均最高，因而选择该类CPP进行后续生物功能评价。

图2 薏苡仁醇溶蛋白的水解度变化

3.4 CPP单次给药降压效果

单次灌胃给药后SHR血压变化趋势如图3所示。灌胃给药后，空白对照组(蒸馏水)SHR血压在整个测量期间内无显著性变化。卡托普利(17.5 mg/kg)组SHR血压在给药后4h降至最低(172.17±3.43)mmHg，作用时间可维持8 h左右，10 h后血压基本恢复。低剂量(125 mg/kgCPP)组给药后4 h血压开始显著降低，6 h血压降至最低为(188.83±3.66)mmHg，与给药前相比整体下降(11.67±3.08)mmHg，作用时间4 h左右。中剂量(250 mg/kgCPP)组SHR血压给药后6 h血压降至最低水平(186.33±2.58)mmHg，较给药前血压下降(14.83±3.06)mmHg。高剂量(500 mg/kgCPP)组SHR给药后4 h血压降至最低值，整体下降(28.83±4.45)mmHg，作用时间可维持6 h左右。

图3 单次给药后SHR血压变化趋势

图4 CPP对小鼠脾淋巴细胞增殖率的影响 注：不同小写字母代表差异显著(P<0.05)

3.5 CPP对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

CPP对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响见表2。阳性对照Con-A可显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖指数的升高(PR=(18.11±2.35)%；P<0.05)。CPP在5～160 μg/mL均可显著促进小鼠脾淋巴细胞的增殖，且PR值呈剂量依赖性增长。当CPP浓度为160 μg/mL时，PR值最高为(17.06±1.13)%，显著高于空白对照组(P<0.05)，与Con-A组相比，无显著差异(P>0.05)。

4 讨论

目前已发现多种醇溶蛋白源ACE抑制肽的报道。李志锐[19]采用Bacillus natto菌产酶水解玉米醇溶蛋白，经SephadexG-25分离后，部分组分ACE抑制率高达89.4%(50 μg/mL)。Hirofumi等[20]由小麦醇溶蛋白的酶解物，分离纯化获得三肽Ile-Ala-Pro，其IC50为2.7 μmol/L，且静脉注射后可显著降低SHR血压。陈倩倩[21]等通过模拟胃肠环境消化大米醇溶蛋白，发现大米醇溶蛋白经胃蛋白酶消化120 min后，产物ACE抑制活性达到最高水平，随后经胰蛋白酶作用，其抑制活性会下降。本研究模拟胃肠道酶环境水解薏苡仁醇溶蛋白获得了具有显著ACE抑制活性的小分子肽，胃肠连续消化产物ACE抑制率低于胃蛋白酶单独消化产物，与已报道的研究结果一致。此外，随着胃蛋白酶消化时间的延长，CPP表现出更高的体外ACE抑制活性，表明长时间酶解不仅可以使醇溶蛋白的水解程度显著上升，还可以显著提高其体外ACE抑制活性。动物实验表明，CPP具有显著的体内降压活性，且在一定的浓度范围内呈剂量依赖性，表明CPP具有显著降压作用，可进一步分离纯化及进行结构鉴定，从而深刻揭示其物质基础。

脾脏作为人体外周最大的免疫器官，含有多种免疫细胞，包括T淋巴细胞，B淋巴细胞和巨噬细胞等，在细胞免疫和体液免疫等方面发挥重要作用。脾脏淋巴细胞增殖反应能力是直接反映机体细胞免疫功能的重要指标，其主要表现为淋巴细胞的活化和分化为免疫活性细胞，从而影响机体的免疫应答能力[22]。本研究证实CPP对小鼠脾淋巴细胞具有显著促增殖作用，且呈现一定的量效关系，为薏苡仁在免疫调节方面的应用提供新的实验数据。

综上，薏苡仁醇溶蛋白源小分子肽在降压、免疫方面显示出一定生物活性，其生物应用价值可望进一步发掘。

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BiologicalActivityofCoixProlaminPeptide

LILing-ling,LIKai,ZHANGYue-yuan,CHENPei-yao,WANGLing-zhi

(CollegeofChineseMateriaMedica,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China)

Objective: To explore the anti-hypertensive and immune effects of Coix prolamin peptide(CPP). Methods: CPP was hydrolyzed under the condition of simulated in vitro digestion to observe its anti-hypertensive activity. ATT method was used to evaluate its effect on spleen lymphocyte proliferation in mice. Results: At the final dose of 0.1 mg/mL, the inhibition rate of the hydrolysate of 4h-pepsin was obviously higher than the hydrolysates of other mixed enzymes. The ACE inhibition rate and the degree of hydrolysis were significantly increased when the pepsin digestion duration extended to 48 h. For single oral CPP administration (125～500 mg/kg), the systolic blood pressure (SBP) of SHR was significantly decreased. Proliferation rate (PR) of splenocytes increased in mice after being treated with 5～160 μg/mL CPP. Conclusion: CPP has anti-hypertensive activity after simulated gastrointestinal digestion and can also exert positive effect on splenocyte proliferation in mice.

Coix; Prolamin; Biopeptide; Anti-hypertension; Immune

R285

A

1002-2392(2017)05-0021-05

2017-02-18

2017-04-30

北京中医药大学课题(2015-JYB-JSMS026)；北京中医药大学课题(2016-JYB-XS068)

李玲玲(1991-)，女，硕士研究生，专业：微生物与生化药学，研究方向：中药活性蛋白及多肽分离与功能研究。

*通讯作者：王灵芝(1973-)，女，博士，副研究员，研究方向：中药活性蛋白及多肽分离与功能研究。