HPLC测定柴胡加龙骨牡蛎汤改善睡眠有效部位中5种化学成分的含量

黄莉莉，耿一玄,许丹丹，杜纳纳

(黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

HPLC测定柴胡加龙骨牡蛎汤改善睡眠有效部位中5种化学成分的含量

黄莉莉，耿一玄,许丹丹，杜纳纳

(黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：建立用HPLC测定柴胡加龙骨牡蛎汤改善睡眠有效部位中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和肉桂酸含量的方法。方法：采用HPLC，Diamonsil C18(250×4.6 mm，5 μm)色谱柱，流动相乙腈-0.5%磷酸水，梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，柱温为25℃。结果：黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和肉桂酸含量分别为1.061%、0.672%、1.168%、0.299%、1.424%。 精密度、重复性、加样回收率的RSD均小于3.0%。 结论：本实验建立的测定方法，操作简捷，数据准确，重现性好，可用于柴胡加龙骨牡蛎汤改善睡眠有效部位的质量控制。

HPLC；柴胡加龙骨牡蛎汤；化学成分；睡眠

柴胡加龙骨牡蛎汤具有改善围绝经期前后诸证的临床疗效[1]。本实验室以往研究结果表明，柴胡加龙骨牡蛎汤改善去卵巢合并应激小鼠睡眠的有效部位为70%醇洗脱组[2]。柴胡加龙骨牡蛎汤由黄芩、桂枝、人参、生姜等组成，其中黄芩为臣药，黄酮类是其主要有效成分，其中汉黄芩素、黄芩苷、黄芩素、汉黄酮类苷为黄酮类中的主要成分[3]，具有明显的镇静和神经保护作用[4-6]。桂枝中的主要化学成分之一为肉桂酸，相关文献报道，桂枝可以协同增强戊巴比妥钠的催眠作用，对中枢神经系统抑制作用明显[7]。由此推测黄酮类成分和肉桂酸可能是柴胡加龙骨牡蛎汤改善睡眠的有效组分之一，对其进行含量测定，有助于保证今后实验用药的质量控制。本实验采用HPLC同时测定柴胡加龙骨牡蛎汤改善睡眠有效部位中5种化学成分，该方法操作简便，具有良好的稳定性、其精密度及重复性均良好，回收率较高，为柴胡加龙骨牡蛎汤改善睡眠的有效部位质量控制提供数据支持。

1 实验仪器与药品

1.1 仪器

高效液相色谱仪,型号为2695(美国Waters公司)；二极管阵列检测器,型号为PDA2998(美国Waters公司)；色谱柱,Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)(美国迪马公司)；超声清洗器,型号为KQ300DE (昆山超声仪器有限公司)；电子分析天平,型号为MS105(上海天平仪器公司)。

1.2 试剂

甲醇,色谱纯,批号为141073 (美国迪马试剂公司)；乙腈,色谱纯,批号为141048(美国迪马试剂公司)；磷酸,HPLC级,批号为20151019(天津科密欧化学试剂有限公司)； D-101型大孔树脂,批号为20140314(天津市汇达化工有限公司)。

1.3 试药

柴胡加龙骨牡蛎汤改善睡眠70%醇有效部位,具体制备方法参照文献[2]，由黑龙江中医药大学中药药理教研室自制，批号：20150326。

黄芩苷，批号为15060914(成都曼思特生物科技有限公司)；汉黄芩苷,批号为15080512(成都曼思特生物科技有限公司)；黄芩素,批号为15070816(成都曼思特生物科技有限公司)；汉黄芩素,批号为15091513(成都曼思特生物科技有限公司)；肉桂酸,批号为15041614(成都曼思特生物科技有限公司)。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件

采用Diamonsil C18色谱柱(250×4.6 mm，5 μm)，梯度洗脱，流动相为A(乙腈)-B(0.5%磷酸水)。洗脱条件见表1；流速：1.0 mL/min；柱温：25℃；检测波长：280 nm；理论板数按黄芩苷峰计算为7069，相邻色谱峰的分离度均大于1.5。以上条件下的供试品与对照品色谱图见图1和图2。

表1 梯度洗脱条件

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备

称取170 mg供试品柴胡加龙骨牡蛎汤70%醇有效部位，加入50 mL甲醇，待充分溶解后，回收甲醇，定容至10 mL，用微孔滤膜(0.45 μm)过滤，备用。

2.2.2 对照品溶液的制备

对照品黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、肉桂酸，分别精密称取适量，置于量瓶中，加甲醇稀释至刻度，分别制成浓度为0.188、0.282、0.376、0.470、0.564 mg/mL的黄芩苷对照品溶液0.136、0.204、0.272、0.340、0.408 mg/mL的汉黄芩苷对照品溶液,0.052、0.078、0.104、0.130、0.156 mg/mL的黄芩素对照品溶液、0.021、0.042、0.063、0.084、0.105 mg/mL的汉黄芩素对照品溶液,0.22、0.44、0.66、0.88、1.1 mg/mL的肉桂酸对照品溶液，用微孔滤膜(0.45 μm)过滤，备用。

图1 柴胡加龙骨牡蛎汤有效部位供试品溶液HPLC图谱注：1-黄芩苷;2-汉黄芩苷;3-肉桂酸;4-黄芩素;5-汉黄芩素

图2 混合对照品溶液HPLC图谱注:1-黄芩苷;2-汉黄芩苷;3-肉桂酸;4-黄芩素;5-汉黄芩素

2.3 标准曲线的制备

依次精密吸取黄芩苷对照品溶液，汉黄芩苷对照品溶液，黄芩素对照品溶液，汉黄芩素对照品溶液，肉桂酸对照品溶液，各10 μL；注入液相色谱仪，进行测定，以色谱峰面积和进样量(μg)作线性回归得标准曲线。见表2。

表2 黄芩中黄酮类成分和桂枝中肉桂酸线性关系考察

2.4 精密度试验

取已知浓度的对照品溶液，分别连续进样10 μL，按2.1色谱条件测定6次，记录色谱图，根据峰面积计算各供试品成分含量，计算RSD。5个对照品RSD值分别为：黄芩苷1.59%、汉黄芩苷0.99%、黄芩素1.46%、汉黄芩素1.52%、肉桂酸0.98%，表明仪器精密度良好。

2.5 重复性试验

按2.2.1方法制备供试品溶液6份，分别取10 μL进样，按照2.1色谱条件，记录色谱图，根据峰面积计算各供试品成分含量，计算RSD。6次测定的RSD值分别为：黄芩苷1.66%、汉黄芩苷1.34%、黄芩素 1.85%、汉黄芩素2.29%、肉桂酸1.70%，表明此方法重复性良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液10 μL，按照2.1色谱条件于0、4、8、12、16、24 h分别测定，记录色谱图，根据峰面积计算各供试品成分含量，计算RSD。RSD值分别为：黄芩苷1.97%、汉黄芩苷2.04%、黄芩素 2.01%、汉黄芩素1.24%、肉桂酸2.24%，表明24 h内供试品溶液稳定。

2.7 加样回收试验

精密称取0.1 g已知含量的供试品 6份，分别加入定量的黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、肉桂酸，按2.2.1方法制备供试品溶液，取10 μL进样，记录色谱图，根据峰面积计算各供试品成分含量，计算回收率，结果见表3。

表3 加样回收试验结果

2.8 样品测定

取3批次不同的供试品，按照2.2.1方法分别制备供试品溶液10 μL，按2.1色谱方法，记录色谱图，根据峰面积计算供试品成分含量。结果见表4。

表4 样品中黄芩苷，汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和肉桂酸含量

三批供试品含量测定结果表明：黄芩苷含量为1.061%，汉黄芩苷含量为0.672%，黄芩素含量为1.168%，汉黄芩素含量为0.299%，肉桂酸含量为1.424%，5种成分总含量为4.624%。

3 讨论

本实验通过对柴胡加龙骨牡蛎汤各组成单味药的成分和药理作用分析，确定黄芩中的黄芩苷，汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和桂枝中的肉桂酸可能为其有效活性成分。在此基础上，对色谱柱，流动相和检测波长进行了选择，最终确定采用Diamonsil C18色谱柱，乙腈-0.5%磷酸水梯度洗脱，检测波长280 nm的色谱条件。本方法具有简便、灵敏、准确，重现性好等优点，可用于分析柴胡加龙骨牡蛎汤改善睡眠有效部位的含量。

中药复方是中医临床应用的主要形式，通过多成分含量测定对中药复方进行质量控制，是保证药效可靠的依据。柴胡加龙骨牡蛎汤中含有人参和柴胡等单味药，所以含有多种皂苷类成分，本实验室已通过高效液相-蒸发光散射检测器对有效部位中的5种皂苷类成分进行了含量的测定[8]。鉴于近年来对黄酮类化合物对中枢神经系统方面广泛的药理作用研究[9]，柴胡加龙骨牡蛎汤中含有单味药黄芩，因此，本方法通过高效液相-二极管阵列检测器对黄酮类成分和肉桂酸进行了含量测定，该结果更有助于对其有效部位进行质量控制，以保证今后的药理学研究数据的可靠与真实性。

[1] 王晓滨,时思毛,班艳红.柴胡加龙骨牡蛎汤加减治疗经断前后诸证的临床观察[J].中医药学报,2010,38(2):125-126.

[2] 杜纳纳,于爽,黄莉莉.柴胡加龙骨牡蛎汤改善围绝经期雌性小鼠睡眠的有效部位研究[J].中药新药与临床药理,2014,25(5):556-559.

[3] 张晓娟，吕勃川.黄芩研究进展[J].中医药学报,2017,45(1):96-99.

[4] 郑勇凤,王佳婧,傅超美,等.黄芩的化学成分与药理作用研究进展[J].中成药,2016,38(1):141-147.

[5] 王晓滨,孔明月,孙荣华,等.柴胡加龙骨牡蛎汤对慢性应激抑郁大鼠行为及海马形态学的影响[J].中医药信息,2014,31(3):50-52.

[6] 王晓滨,孙荣华,胡继平,等.柴胡加龙骨牡蛎汤对慢性应激抑郁大鼠海马BDNF表达的影响[J].中医药学报,2014,42(3):143-145.

[7] 赵建一.桂枝的药理研究及临床新用[J].光明中医,2010,25(8):1546.

[8] 许丹丹,杜纳纳,耿一玄,等.HPLC-ELSD测定柴胡加龙骨牡蛎汤改善睡眠有效部分中5种皂苷类成分的含量[J].中国药学杂志,2017,52(10):861-864.

[9] 张庆建,赵毅民,杨明,等.黄酮类化合物对中枢神经系统的作用[J].中国中药杂志,2001,26(8):5-8.

DeterminationofFiveChemicalComponentsofChaihuJiaLongguMuliDecoctionforImprovingSleepbyHPLC

HUANGLi-li,GENGYi-xuan,XUDan-dan,DUNa-na

(PharmaceuticalCollege,HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective: To establish a method for content determination of baicalin, wogonoside, baicalein, wogonin, and cinnamic acid in Chaihu Jia Longgu Muli decoction by HPLC. Methods: The chromatographic separation was performed using a Diamonsil C18 column(250 mm×4.6 mm, 5 μm) with 25℃ column temperature. The mobile phase was composed of a gradient elution of acetonitrile and 0.5% phosphoric acid at flow rate of 1.0mL·min. Results: The average contents of baicalin, wogonoside, baicalein, wogonin, and cinnamic acid were respectively 1.061%, 0.672%, 1.168%, 0.299%, and 1.424%. The precision, reproducibility and sample recovery of RSD was lower than 3.0%. Conclusion: The method with simple process, good accuracy and reproducibility, is shown to be suitable for the quality control of the effective components of Chaihu Jia Longgu Muli decoction for improving sleep.

HPLC; Chaihu Jia Longgu Muli decoction; Chemical components; Sleep

R284.2

A

1002-2392(2017)05-0017-04

2017-04-16

2017-09-28

黑龙江省普通高等学校青年学术骨干支持计划(1254G054);黑龙江省博士后科研启动金(LBH-Q13161);黑龙江中医药大学校科研基金资助(2012bs01);黑龙江中医药大学"优秀创新人才支持计划"(2012RCD02);国家自然科学基金青年基金(30801528)

黄莉莉(1978-)，女，博士，副教授，主要从事中药改善睡眠作用及作用机制研究。