芽孢杆菌dhs-330-021对链状亚历山大藻的溶藻机理研究

司晓光，张晓青，郝建安，姜天翔，杜瑾，杨波，张爱君，王静

国家海洋局 天津海水淡化与综合利用研究所，天津 300192

芽孢杆菌dhs-330-021对链状亚历山大藻的溶藻机理研究

司晓光，张晓青，郝建安，姜天翔，杜瑾，杨波，张爱君，王静

国家海洋局 天津海水淡化与综合利用研究所，天津 300192

目的：本实验室通过转座突变技术获得了一株高产表面活性物质的芽孢杆菌dhs-330-021，研究其对链状亚历山大藻的抑制效果，及其溶藻作用方式。方法：在链状亚历山大藻的培养液中添加dhs-330-021的发酵液等，间隔一定时间计数获得藻细胞的数量。结果：菌株dhs-330-021培养后期的发酵液溶藻效果好于培养前期和中期；在一定浓度范围内，dhs-330-021的发酵液对不同生长期的链状亚历山大藻均有溶藻效果，其中对延滞期和稳定期效果最好；菌株的发酵液和无菌上清液的溶藻效果明显，而菌悬液溶藻效果较差。结论：菌株dhs-330-021能显著抑制链状亚历山大藻的生长，其溶藻方式属于间接溶藻。

链状亚历山大藻；芽孢杆菌；溶藻机理；表面活性剂

链状亚历山大藻（Alexandrium catenella）是我国沿海常见的赤潮藻，是典型的产毒素甲藻，能分泌麻痹性贝毒素（paralytic shellfish poisoning，PSP）[1-2]。链状亚历山大藻体长20～50μm，宽 16～45μm，通常2、4或8个藻细胞以链状形式存在，在暴发赤潮的水域藻细胞数可达106/L[3]。

赤潮生物的暴发不仅会破坏整个海洋生态系统平衡，而且会对海洋经济生物产生危害，其分泌的贝毒素经过食物链的传递进入人体，也会危害人体健康[4-5]。目前，赤潮防治主要包括物理、化学和生物方法，其中微生物防治因安全性好、成本低，应用前景十分广阔[6]。

微生物溶藻是溶藻菌通过直接或间接方式抑制藻类生长，或溶解藻细胞、杀死藻细胞的过程[7-8]。研究表明，某些细菌可以通过分泌胞外酶、表面活性物质和抗生素等溶解性杀藻物质杀死藻细胞，如枯草芽孢杆菌C1的培养液所含表面活性物质可以显著抑制铜绿微囊藻和鱼腥藻的生长，对这2种水华藻的去除率达70％～80％[9-12]，从而表明这类细菌胞外活性物质在赤潮调控上具有巨大潜力，其活性物质的结构及性质的鉴定，以及高效、大量制备技术必将是今后生物化治理赤潮的研究核心[13-15]。

本课题组前期分离获得一株产表面活性剂的海洋芽孢杆菌，并通过分子生物学手段构建了高效产表面活性剂突变株，优化了培养条件[16]。在此，我们进一步探讨了其对典型赤潮藻——链状亚历山大藻的抑制作用，为赤潮海域的水质净化与处理提供一定的科学依据和实践基础。

1 材料与方法

1.1 材料

芽孢杆菌dhs-330-021为本实验室保存菌种，由dhs-330转座突变库筛选获得，具有产表面活性物质的特性；链状亚历山大藻购自上海光语生物科技有限公司，为典型赤潮藻。

dhs-330-021发酵培养基：葡萄糖32g（单独灭菌），尿素 5.0g，酵母提取物 1.2g，Na2HPO4·12H2O 3.0g，KH2PO40.8g，MgSO4·7H2O 0.15g，微量元素溶液（CaCl27.5g/L，FeSO4·7H2O 2.0g/L，MnSO4·H2O 2.0g/L）1.0mL，定容至 1 L 并调整pH值为7.0，115℃灭菌30min。

链状亚历山大藻培养基（f/2培养基）：NaNO3（75.0g/L）1mL，NaH2PO4·H2O（5.0g/L）1mL，NaSiO3·9H2O（30.0g/L）1mL，微量元素溶液[FeCl3·6H2O 3.15 g，Na2EDTA ·2H2O 4.36 g，CuSO4·5H2O（9.8g/L）1mL，NaMoO4·2H2O（6.3g/L）1mL，ZnSO4·7H2O（22.0g/L）1mL，CoCl2·6H2O（10.0g/L）1mL，MnCl2·4H2O（180.0g/L）1mL，用水定容至1 L]1mL，维生素溶液[维生素B1200 mg，维生素 H（1.0g/L）1mL，维生素 B12（1.0g/L）1mL，用水定容至1 L]0.5mL，用过滤海水定容至1 L。

1.2 菌株dhs-330-021生长曲线测定

取100mL灭菌的发酵培养基加入250mL无菌三角瓶中，接种活化的dhs-330-021菌液，接种量1％，180r/min振荡培养，培养温度30℃，每隔6h取样测定发酵液的吸光度和表面活性值。

1.3 链状亚历山大藻的生长周期测定

将活化的链状亚历山大藻接种于f/2培养基中，接种量5％，培养温度22℃，光照强度2500 lx，光暗比12h∶12h，每天取样用鲁格试剂固定藻细胞，并用血球计数板计数，绘制生长曲线。

1.4 不同生长期发酵液的溶藻效果研究

按照测定的dhs-330-021生长曲线，取不同生长阶段的发酵液，按2％加入处于对数生长期的链状亚历山大藻溶液中，空白组加入2％的dhs-330-021发酵液，每组设立3个平行。

1.5 菌株dhs-330-021对不同生长期藻的溶藻效果研究

取处于对数生长末期的菌株dhs-330-021的发酵液，按1.0％的终浓度，分别加入处于延滞期、对数期和稳定期的链状亚历山大藻液中，培养温度 22℃，光照强度 2500 lx，光暗比12h∶12h，每隔24h取样，并用血球计数器计数。

1.6 菌株dhs-330-021的溶藻作用方式研究

将菌株dhs-330-021接种于发酵培养基中，30℃、180r/min振荡培养24h，取50mL发酵液，10 000r/min离心 15min，上清液经 0.22μm 滤膜过滤除菌，菌体沉淀用f/2培养基洗涤2～3次，并重悬于50mL f/2培养基。

本实验共设置4个处理组，A组为发酵液，B组为无菌上清液，C组为菌悬液，D组为发酵培养基。将4组处理液分别按0.5％、1.0％、1.5％和2.0％添加到处于对数生长期的藻细胞培养液中，各组均设置3组重复。每隔24h取样，用鲁格试剂固定藻细胞，在显微镜下计数。

2 结果与讨论

2.1 菌株dhs-330-021生长曲线

从图1可以看出，菌株dhs-330-021的对数生长期为12～30h，而后进入稳定期。由于dhs-330-021是一株产表面活性物质的菌株，结合实验数据可以确定发酵液表面活性值的变化过程，进而可以分析对链状亚历山大藻细胞起溶藻作用的是dhs-330-021菌体本身还是菌体分泌的表面活性物质。

2.2 链状亚历山大藻生长周期

活化的链状亚历山大藻接种于f/2培养基，生长曲线如图2所示。接种后前3d为延滞期，藻细胞密度平稳增加，而后进入9d左右的对数生长期，藻细胞密度迅速增加，达到最高的2.6×104/mL。实验中发现接种量对链状亚历山大藻的生长有很大影响，接种量过小会增加藻细胞的延滞期，而且最大藻密度较低。为了研究过程中的一致，实验中统一接种量为5％。

2.3 链状亚历山大藻与菌株dhs-330-021的不同生长期对溶藻效果的影响

由图3A可知，与终浓度2％的培养基处理的对照组相比，用处于对数生长末期的dhs-330-021的发酵液能显著降低藻细胞数量，菌株dhs-330-021的发酵液对不同生长期的链状亚历山大藻抑制效果不同，表现为对延滞期和稳定期的藻细胞抑制效果强于处于对数生长期的藻细胞。以存活率（存活率=藻细胞终密度/藻细胞初始密度×100％）作为评价溶藻效果的依据，经dhs-330-021发酵液处理后，延滞期、对数生长期和稳定期藻细胞的存活率分别为6.25％、16.39％和9.19％，均有较强的抑制作用，但dhs-330-021对延滞期和稳定期的藻细胞抑制效果明显好于对数生长期。

图1 菌株dhs-330-021生长曲线

图2 链状亚历山大藻生长曲线

图3 链状亚历山大藻与dhs-330-021的不同生长期对溶藻效果的影响

图3B示不同培养阶段（6、24、36h）的 dhs-330-021发酵液对藻细胞的抑制作用，分别代表了dhs-330-021的发酵初期、中期和后期。处于对数生长期的藻液经发酵培养基和不同培养阶段的发酵液处理后，藻细胞数量变化不同，随着发酵液培养时间的增加，藻细胞的密度减小，经36h的发酵液处理96h后藻细胞存活率仅为2.61％。表面活性剂具有较强的表面活性，可吸附在藻细胞表面，并与细胞膜的脂质相互作用，破坏膜的完整性，导致细胞内容物渗出；同时可凝固细胞内蛋白，致使酶和结构蛋白变性，进而影响藻细胞的代谢，最终致其死亡[17-19]。菌株dhs-330-021是一株产表面活性物质的菌株，随着发酵时间的延长，菌株dhs-330-021分泌的表面活性物质逐渐增多，抑藻效果相应地逐渐增强。

dhs-330-021不同生长期的发酵液对链状亚历山大藻的溶解活性不同，延滞期活性较低，稳定期活性最高，添加量越大溶藻活性越高；对处于不同生长期的链状亚历山大藻溶藻活性也不相同，延滞期和稳定期的效果优于对数生长期。

2.4 菌株dhs-330-021的溶藻效果图

如图4所示，链状亚历山大藻液经dhs-330-021发酵液处理后，一部分藻细胞裂解死亡，还有一部分藻细胞保持完整，但也处于静止状态，而正常状态下的藻细胞在显微镜下是运动的。实验过程中观察发现，随着dhs-330-021作用时间的延长，完整藻细胞的数目逐渐减少，藻液原来的黄褐色也逐渐变浅、变浑浊。

2.5 菌株dhs-330-021的溶藻方式研究

由图5可以看出，添加发酵培养基组对藻液中藻细胞的密度没有影响，藻细胞呈现逐渐增加的趋势；添加发酵液和无菌上清液的藻液中藻细胞浓度均呈下降趋势，经过计算，处理96h后添加2％发酵液和2％无菌上清液的藻液中藻细胞的存活率分别为1.24％和1.96％；不同浓度的发酵液和无菌上清液对藻细胞的抑制程度不同，添加浓度越高，抑制效果越强。综合以上可以说明对藻细胞有溶解作用的物质存在于发酵上清液中。添加菌悬液的一组对藻细胞的抑制效果较差，只有在添加1.5％和2％时藻细胞的浓度才基本保持不变，说明dhs-330-021菌体本身对藻细胞的溶解作用较小。微生物溶藻主要有2种方式，即直接溶藻和间接溶藻[20-22]。直接溶藻，是指微生物通过直接接触藻细胞，吸附或进入藻细胞内从而进一步杀死藻细胞；间接溶藻，是指微生物不须与藻细胞直接接触，通过与藻细胞竞争有限的营养或释放特异性或非特异性的溶藻物质杀死藻细胞[23-25]。本研究中的dhs-330-021能产生表面活性剂，其含有的疏水基团和亲水基团能很好地与藻细胞膜相互作用，进而影响藻细胞的完整性，导致藻细胞死亡[26]。

图4 菌株dhs-330-021对链状亚历山大藻的溶解效果

图5 菌株dhs-330-021对链状亚历山大藻的作用方式

菌株dhs-330-021的溶藻活性物质主要存在于胞外，其溶藻方式属于间接溶藻；溶藻实验表明，在一定浓度范围内，随着发酵液或上清液浓度的增加，溶藻效果显著提高。

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Lysing Mechanism of Bacillus sp.dhs-330-021 on Alexan⁃drium catenella

SI Xiao-Guang,ZHANG Xiao-Qing,HAO Jian-An,JIANG Tian-Xiang,DU Jin,YANG Bo,ZHANG Ai-Jun,WANG Jing*
Institute of Seawater Desalination and Multipurpose Utilization,State Oceanic Administration,Tianjin 300192,China
*Corresponding author,E-mail:Wang_nana@163.com

Objective:Bacterial strain dhs-330-021 was a high surfactivity strain obtained by transposon mutagen⁃esis technology in our lab,this study aims to explore the suppression effect and algicidal effect on Alexandrium catenella.Methods:The fermentation broth of dhs-330-021 was added into A.catenella culture.The numbers of al⁃gae cells were counted at certain times.Results:Strain dhs-330-021 had better algae-lysing effect of fermenta⁃tion broth in late stage than in earlier and middle stage.Within the certain range of concentration,the fermenta⁃tion broth of dhs-330-021 has the positive effect on A.catenella throughout growth period,especially in the lag phase and stationary phase.Compared with the poor effect that bacterial suspension had,both fermentation broth and sterile supernatant had evident algae-lysing effect.Conclusion:Strain dhs-330-021 inhibits A.catenella obvi⁃ously through an indirect algae-lysing process.

Alexandrium catenella;Bacillus sp;algae-lysing mechanism;surfactant

Q938

A

1009-0002（2017）04-0485-05

2016-12-19

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（K-JBYWF-2015-G17）；海洋公益性行业科研专项（201405017-04）；中央级科研院所基本科研业务费团队项目（K-JBYWF-2015-T11）

司晓光（1988- ），男，助理工程师，（E-mail）buburensheng@163.com

王静，（E-mail）Wang_nana@163.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.015