尖锐湿疣皮损中Caspase 8与p-Akt的表达

陈敏聪 王建琴 方锐华 贾淑青 莫友 莫金雪

510642广州，华南农业大学医院皮肤科（陈敏聪）；广州医科大学皮肤病研究所 广州市皮肤病防治所（王建琴）；广州医科大学附属广州市第一人民医院皮肤科（方锐华、莫友）；广州医科大学附属广州第一人民医院南沙医院皮肤科（贾淑青、莫金雪）

尖锐湿疣皮损中Caspase 8与p-Akt的表达

陈敏聪 王建琴 方锐华 贾淑青 莫友 莫金雪

510642广州，华南农业大学医院皮肤科（陈敏聪）；广州医科大学皮肤病研究所 广州市皮肤病防治所（王建琴）；广州医科大学附属广州市第一人民医院皮肤科（方锐华、莫友）；广州医科大学附属广州第一人民医院南沙医院皮肤科（贾淑青、莫金雪）

目的探讨Caspase 8与p-Akt在尖锐湿疣皮损中的表达及意义。方法 收集尖锐湿疣30例、宫颈癌20例、正常皮肤（包皮）20例，采用免疫组化检测以上组织中Caspase 8及p-Akt的表达及分布。结果Caspase 8在尖锐湿疣皮损、宫颈癌、正常皮肤中阳性率分别为23.33%、80%、90%。Caspase 8在尖锐湿疣中的表达强度显著低于正常皮肤（P＜0.01）和宫颈癌组织（P＜0.001）。p-Akt在尖锐湿疣皮损、宫颈癌组织、正常皮肤组织中的阳性率分别为93.33%、95%、90%。p-Akt在尖锐湿疣皮损的表达强度显著高于正常皮肤组织（P＜0.001），低于宫颈癌组织（P＜0.001）。在尖锐湿疣皮损和正常皮肤组织中，Caspase 8与p-Akt的表达无相关性。在宫颈癌中，Caspase 8与p-Akt的表达存在显著的正相关（r=0.369，P＜0.05）。结论Caspase 8的凋亡启动受抑制及p-Akt的抗凋亡作用可能参与了尖锐湿疣的发生发展。

尖锐湿疣；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8；细胞凋亡；p-Akt

尖锐湿疣（CA）是人乳头瘤病毒（HPV）感染引起的性传播疾病，存在易复发、难治愈的特点。目前认为，CA的发病及复发主要由T细胞介导的对HPV感染细胞的免疫抑制为主，但确切机制尚未明确。宫颈癌是女性常见生殖道肿瘤，其发病与高危型HPV（HPV16、18）的感染密切相关。研究证实，HPV感染能诱导细胞凋亡［1］。当细胞凋亡受到抑制的时候，细胞就会因凋亡异常而异常增殖，甚至向恶性发展。Caspase家族作为凋亡的主要执行者，是细胞凋亡的核心。PI3K/Akt通路与细胞凋亡、增殖、代谢等密切相关。p-Akt即磷酸化的Akt，是Akt的活性形式。我们用免疫组化EnVision法检测Caspase 8与p-Akt在CA及宫颈癌的表达，旨在探讨CA和宫颈癌的发病中是否存在凋亡机制异常。

一、对象与方法

1.对象：CA组30例，男17例，女13例，年龄18～76岁（28.6±6.5）岁，病程2周至4个月（1.3±0.8）个月，标本分别取自肛周、阴囊、尿道口、大小阴唇、宫颈等患CA部位。30例CA患者均在组织病理学上有典型的空泡细胞及免疫组化检查HPV阳性。宫颈癌组20例，年龄19～67岁（34.5±7.0）岁，病程3周至16个月（5.3±3.3）个月。20例宫颈癌患者均符合宫颈癌的病理诊断标准，病理分期上，ⅠB期2例，ⅡA期4例，ⅡB期3例，ⅢA期7例，ⅢB期4例。CA组和宫颈癌组患者取材前1个月内均未使用过影响机体免疫功能的药物，且不伴有自身免疫性疾病，梅毒及艾滋病血清学检查阴性。对照组20例的皮肤取自正常包皮环切术，年龄18～35岁（20.3±4.5）岁，均无罹患恶性肿瘤亦无接受过任何免疫治疗。本研究经广州市第一人民医院医学伦理学委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

2.试剂：兔抗人Cleaved Caspase 8单克隆抗体、兔抗人Phospho-Akt单克隆抗体购于美国Cell Signaling Technology公司；免疫组化检测试剂盒为GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用型试剂盒，购于丹麦Dako公司。

3.方法：免疫组化EnVision法：步骤按试剂盒说明书进行。取CA皮损及宫颈癌病灶，固定、脱水、石蜡包埋，连续4 μm切片。常规二甲苯脱蜡，抗原120℃修复3 min，自然冷却后，3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶，滴加一抗（Caspase 8稀释至1∶200，p-Akt稀释至1∶100）4℃孵育过夜，再滴加二抗37℃孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，无水乙醇脱水，封片。用结肠癌组织作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。

判定标准：Caspase 8及p-Akt均以胞质或胞膜出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性表达。以胞质或胞膜着棕黄色为阳性判断标准；将染色深度（I）分为4级：无染色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；在高倍镜下（×400）随机计数5个视野，计算阳性细胞占同类细胞的比例（P）：阳性表达细胞数＜10%计0分，11%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，＞75%计4分。分别计算CA、正常皮肤组织及宫颈癌细胞的组织学评分（H）：H=I×P。0分为阴性（-），1～4分为弱阳性（+），5～8分为中度阳性（++），9～12分为强阳性（+++）。

4.统计学分析：采用SPSS 20．0统计软件对数据进行统计学分析，CA皮损、宫颈癌组织和正常皮肤组织间Caspase 8及p-Akt分别进行方差齐性检验，单因素方差分析比较Caspase 8及p-Akt在各组间的差异性，方差不齐则用秩和检验。Caspase 8及p-Akt在CA皮损、宫颈癌及正常皮肤组织中表达的相关性采用Spearman等级相关分析。

二、结果

1.Caspase 8及p-Akt在CA皮损、宫颈癌组织及正常皮肤中的表达：Caspase 8及p-Akt在CA皮损和宫颈癌组织中均有不同程度的阳性表达（表1）。Caspase 8在CA皮损中阳性细胞局限于基底层、棘层细胞，胞质着色多为棕黄色至淡黄色，全部为弱阳性表达（图1），阳性率为23.33%；宫颈癌组织中，Caspase 8阳性细胞呈散在或局灶阳性分布，癌组织胞质着色较深，多为棕褐色（图2），阳性率为80%；在正常皮肤组织中，Caspase8阳性细胞集中在基底层，个别在棘层也有表达，着色多为棕黄色，阳性率为90%。Caspase 8在CA皮损中的表达水平显著低于正常皮肤组织（P＜0.01）和宫颈癌组织（P＜0.001），而宫颈癌组织表达Caspase 8的水平则显著高于正常皮肤（P＜0.05）。

p-Akt在CA皮损中阳性细胞分布于基底层、棘层细胞及颗粒层下部，胞质被染成棕红色，多数为中度至强阳性表达（图3），阳性率为93.33%；在宫颈癌组织中，阳性细胞呈弥漫性强阳性表达（图4），胞质染成棕红色，阳性率为95%；正常皮肤组织表达p-Akt阳性细胞主要分布于基底层，少数棘层细胞也有表达，着色多为棕黄色，阳性率为90%。p-Akt在CA皮损中的表达水平显著高于正常皮肤（P＜0.001），低于宫颈癌（P＜0.001），宫颈癌组织表达Caspase 8的水平则显著高于正常皮肤（P＜0.001）。

2.Caspase 8和p-Akt在CA皮损及宫颈癌组织中表达的差异性分析：Caspase 8和p-Akt在宫颈癌组织中的表达均显著高于CA皮损（P＜0.01）。

3.Caspase 8和p-Akt在CA皮损及宫颈癌组织中表达的Spearman等级分析：CA皮损和正常皮肤组织中，Caspase 8与p-Akt的表达无相关性。在宫颈癌中，Caspase 8与p-Akt存在显著的正相关（r=0.369，P＜0.05）。

三、讨论

研究发现，Caspase 8的编码基因CASP8由于其甲基化、基因突变等原因造成Caspase 8表达缺失，与肝癌、结肠癌、前列腺癌、神经母细胞瘤等多种肿瘤密切相关。很多发展中的肿瘤会表达致癌活性，比如表达超生理量的Caspase抑制剂［2］。c-FLIC，Caspase 8的抑制剂，已被证实在CA中无论RNA水平还是蛋白水平都存在异常高表达［3］。本研究结果显示，CA组Caspase 8的表达水平显著低于正常皮肤组（P＜0.01），提示CA的发病与作为凋亡启动者的Caspase 8密切相关，CA的发生、发展可能与Caspase 8缺失引起的凋亡启动障碍有关。推测，可能是角质形成细胞被HPV感染后导致其表达Caspase 8减少，引起细胞凋亡减少以及过度增殖。Caspase 3是凋亡的重要执行者之一，证实在CA中的表达也是受抑制的［4］，本实验结果与之相符。

表1 尖锐湿疣组、宫颈癌组、正常皮肤组织组Caspase 8及p-Akt的表达情况（例数）

图1 Caspase 8在尖锐湿疣皮损中大部分呈阴性，少数呈弱阳性表达，阳性细胞分布于基底层及棘细胞层，胞质染棕色（EnVision×400）

图2 Caspase 8在宫颈癌组织中呈散在和局灶阳性，癌组织细胞质染棕褐色（EnVision×400）

图3 p-Akt在尖锐湿疣皮损中呈中度至强阳性表达，基底层、棘层细胞胞质染棕红色（EnVision×400）

图4 p-Akt在正常皮肤组织呈弱阳性表达，基底层细胞的细胞质染粽红色（EnVision×400）

Caspase 8在很多上皮来源的肿瘤组织中表达并不常是缺失［5］。本研究结果显示，宫颈癌组Caspase 8的表达水平显著高于正常皮肤组（P＜0.05）和CA组（P＜0.001），提示Caspase 8可能参与促宫颈癌的发生、发展，而是否参与肿瘤的转移尚待研究。目前已明确，宫颈癌与HPV-16、18、31、33等高危型HPV感染密切相关［6］。而这些高危型HPV产生致癌作用的原因可以归结于它们能产生E6、E7，这两种癌基因蛋白可以阻止效应细胞与FADD及Caspase 8介导的凋亡［7］。仅有一少部分女性感染了HPV会发展为宫颈癌，宿主的遗传特质可能在其中起了重要作用。

Akt是PI3K信号通路下游的一个重要靶点。PI3K/Akt通路在调节细胞凋亡、增殖、生长及代谢等过程起着重要作用［8］。p-Akt的生物学作用大致可以归纳为抑制细胞凋亡、促进增殖和细胞生长。本研究结果显示，CA组p-Akt的表达水平显著高于正常皮肤组（P＜0.001），与蔓小红等［9］研究结果一致，提示p-Akt参与CA的发生发展，可能不是单一的机制。另外，p-Akt还可进一步上调细胞周期蛋白因子的表达，通过加快细胞周期来参与CA的发病。本研究结果还显示，p-Akt在宫颈癌组的表达水平显著高于正常皮肤组和CA组，提示p-Akt参与促成宫颈癌的发生发展。本研究相关性分析结果表明，在CA皮损和正常皮肤组织中，Caspase 8与p-Akt的表达无相关性。而在宫颈癌中，Caspase 8与p-Akt的表达存在显著的正相关，提示在宫颈癌的发生发展中，Caspase 8与p-Akt的表达模式可能存在一定的联系。

声明本文于广州医科大学附属广州市第一人民医院皮肤科读研期间完成

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Expression of Caspase 8 and phospho-Akt in condyloma acuminatum lesions

Chen Mincong,Wang Jianqin,Fang Ruihua,Jia Shuqing,Mo You,Mo Jinxue

Department of Dermatology,Hospital of South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China（Chen MC）;Institute of Dermatology,Guangzhou Medical University,Guangzhou Institute of Dermatology,Guangzhou 510095,China（Wang JQ）;Department of Dermatology,Guangzhou First People′s Hospital,Affiliated to Guangzhou Medical University,Guangzhou 510180,China（Fang RH,Mo Y）;Department of Dermatology,Guangzhou Nansha Central Hospital,Guangzhou First People's Hospital,Affiliated to Guangzhou Medical University,Guangzhou 511457,China（Jia SQ,Mo JX）

Wang Jianqin,Email:jianqinwang@foxmail.com

ObjectiveTo determine the expression of Caspase 8 and phospho-Akt（p-Akt）in condyloma acuminatum（CA）lesions,and to evaluate their significance.MethodsSkin lesion samples were collected from 30 patients with CA,cancer tissue samples from 20 with cervical cancer,and normal skin samples from 20 healthy controls.All the samples were subjected to paraffin embedding.An immunohistochemical study was conducted to determine the expression and distribution of Caspase 8 and p-Akt in the above samples.ResultsThe expression rate of Caspase 8 was significantly lower in CA lesions（23.33%）than in normal skin samples（90%,P＜ 0.01）and cervical cancer lesions（80%,P＜ 0.001）.Moreover,the expression rate of p-Akt in CA lesions（93.33%）was significantly higher than that in the normal skin samples（90%,P＜ 0.001）,but lower than that in the cervical cancer lesions（95%,P＜ 0.001）.No significant correlations were observed between the expression of Caspase 8 and p-Akt in either CA lesions or normal skin samples.However,the expression of Caspase 8 was positively correlated with the expression of p-Akt in cervical cancer lesions（r=0.369,P＜ 0.05）.ConclusionBoth suppressed apoptosis initiation of Caspase 8 and anti-apoptotic effect of p-Akt may be involved in the occurrence and development of CA.

Condylomata acuminata;Caspase 8;Apoptosis;p-Akt

王建琴，Email：jianqinwang@foxmail.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.05.013

2016-12-21）

（本文编辑：吴晓初）