120株奶牛乳腺炎流行病原菌的分类和耐药谱分析*

王雪梅，郭红霞,郭莉娟,2，林 琳,2，李建龙,2，代 敏,2，孙丰慧,2Δ.成都医学院 检验医学院(成都，60500)；2.成都医学院 四川省动物源性食品兽药残留防控技术工程实验室(成都，60500)

·论著·

120株奶牛乳腺炎流行病原菌的分类和耐药谱分析*

王雪梅1，郭红霞1,郭莉娟1,2，林 琳1,2，李建龙1,2，代 敏1,2，孙丰慧1,2Δ
1.成都医学院 检验医学院(成都，610500)；2.成都医学院 四川省动物源性食品兽药残留防控技术工程实验室(成都，610500)

目的通过对流行于四川成都、眉山和绵阳的奶牛乳腺炎病原菌进行分类和耐药性分析，为奶牛乳腺炎的临床合理用药提供科学依据。方法采用K-B法测定了临床分离的120株奶牛乳腺炎病原菌对青霉素、链霉素、四环素、红霉素、庆大霉素、喹诺酮类、头孢噻吩和头孢噻肟8种抗生素的药物敏感性。结果120株奶牛乳腺炎病原菌中91株病原菌表现为耐药，耐药率为75.8%，大部分病原菌耐受1种(34.0%)或2种抗生素(33.0%)。病原菌对8种抗生素的敏感性与临床用药规律呈一定的相关性，其中分离病原菌对青霉素和链霉素的耐药率最高，分别为65.2%和64.8%；其次为四环素和红霉素，耐药率分别为26.7%和30.3%；对环丙沙星的敏感性最好，敏感率为89.2%，提示其为该地区治疗奶牛乳腺炎的有效药物。结论该地区奶牛乳腺炎病原菌以葡萄球菌和大肠埃希菌最为常见，所试奶牛乳腺炎病原菌耐药率高，部分菌株表现为多重耐药，提示应合理规范使用抗生素，减缓耐药菌株的产生。

耐药性；奶牛乳腺炎；病原菌；药物敏感性

奶牛乳腺炎是指在产后或者犊牛时病原微生物侵入乳房[1]或者疾病继发、饲养管理不当等应激因素使奶牛乳腺实质和间质的炎症[2-3]。奶牛乳腺炎是奶牛养殖中的常见病，该病不但导致奶牛产奶量下降，牛奶品质下降[4-6]，而且牛奶中的细菌毒素还会影响人体健康[7-8]。我国奶牛临床型乳腺炎的发病率达9.7%～55.6%[9]，是奶牛产业危害最为严重的疾病之一，造成巨大的经济损失[10-11]。在奶牛乳腺炎的治疗中，抗生素应用非常广泛，由于抗生素的过量或不合理使用，耐药菌数量越来越多，常用抗生素的治疗效果不佳。因此，对临床分离乳腺炎病原菌进行药物敏感性分析可为临床合理用药提供依据。

前期临床调查发现,目前四川成都、绵阳和眉山三地部分奶牛场主要采用青霉素、链霉素、红霉素和四环素防治临床型乳腺炎，其次为庆大霉素和环丙沙星，仅在顽固性乳腺炎防治中使用头孢类抗生素。为此，结合奶牛场的用药规律及目前耐药现状，本实验选择了临床常用抗生素如青霉素、链霉素、四环素和红霉素等；相对用得较少的氨基糖苷类中的庆大霉素和喹诺酮类中的环丙沙星；以及几乎不用的头孢类抗生素，即第一代头孢类抗生素即头孢噻吩、第三代头孢类抗生素头孢噻肟，分析临床分离的120株奶牛乳腺炎病原菌对这8种抗菌药物的敏感性，为临床奶牛乳腺炎治疗中抗生素的合理使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 菌株 质控菌株：大肠埃希菌 (Escherichiacoli) ATCC25922，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923(均由四川抗菌素工业研究所赠送)。受试菌株：分离于四川成都、眉山、绵阳三地不同规模的奶牛场，并经VETEK 32全自动微生物分析系统及16S rDNA序列分析鉴定的奶牛乳腺炎病原菌，共15个属120株，包括葡萄球菌属33株、大肠埃希菌17株、单胞菌属12株、鲁氏不动杆菌11株、吉氏库特氏菌属9株及其它种属的病原菌26株(表1)。

1.1.2 培养基 Mueller-Hinton agar培养基由英国Oxoid公司生产。营养琼脂，购自北京奥博星生物技术有限责任公司；0.5麦氏比浊管，购自BioMerieux SA公司；Tween-80，购自国药集团化学试剂有限公司； 96-孔板，购自加拿大Jet Biofil公司。

1.1.3 药敏纸片 本研究中所使用的药敏纸片均购自英国Oxoid公司：青霉素(P10，规格10 μg/片)；四环素(TE30，规格30 μg/片)；红霉素(E15，规格 15 μg/片)；链霉素(S10，规格10 μg/片)；庆大霉素(CN10，规格10 μg/片)；头孢噻吩(KF30，规格30 μg/片)；头孢噻肟(CTX30，规格30 μg/片)；环丙沙星(CIP5，规格5 μg/片)。

1.1.4 主要仪器 Vitek Densichek(bioMeriéux,Inc.)；Labo Autoclav(MLS-3780，Sanyo)；CO2Incubator(MOC-15A，Sanyo)；节能净化工作台(成都新光非兰特净化工程有限公司)；电子天平(JA1003，上海永亨光学仪器制造有限公司)。

1.2方法

1.2.1 菌液制备 将药敏质控菌和受试菌平板划线活化，于37 ℃中过夜培养。挑选单菌落，并用生理盐水将菌液浓度调为0.5麦氏浓度。

1.2.2 抗生素敏感性试验 以大肠埃希菌 (E.coli) ATCC25922和金黄色葡萄球菌 (S.aureus) ATCC25923为药敏质控菌株，采用美国临床实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推荐的Kirby-Bauer法[12]，测定120株奶牛乳腺炎病原菌对8种常用抗菌药物的敏感性。具体试验方法及敏感(S)、中介(I)和耐药(R)的判定标准参考CLSI抗微生物药物敏感性试验执行标准(2016年版)[13]。

2 结果

2.1病原菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性分析

参考CLSI抗微生物药物敏感性试验执行标准(2016年版)，测定了四川部分奶牛场分离的120株奶牛乳房炎病原菌对青霉素、第一代头孢噻吩和第三代头孢类抗生素头孢噻肟等3种β-内酰胺类抗生素的药物敏感性。大部分受试菌株对青霉素的不敏感，耐药率为65.2%。受试菌株对头孢噻吩、头孢噻肟头孢类抗生素的敏感性比较高，其中头孢噻吩对革兰阳性菌的抑菌效果较好，对葡萄球菌属、链球菌属、巨型球菌属、吉氏库特氏菌属、棒状杆菌属细菌的抑菌效果最好，抑菌率为100.0%(表1)。

2.2病原菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性分析

参考CLSI抗微生物药物敏感性试验执行标准(2016年版)，测定了54株革兰阴性菌对链霉素的药物敏感性。研究发现，大部分革兰阴性菌对链霉素的敏感性较差，耐药、中介及敏感的菌株分别占64.9%、14.8%及20.3%；其中产吲哚金黄杆菌对链霉素的敏感性最差，受试的6株菌株均表现为耐药；庆大霉素的抑菌效果较好，76.7%的受试菌株表现为敏感，其中对大肠埃希氏菌、吉氏库特氏菌、阴沟肠杆菌及芽孢杆菌属细菌的抑菌效果最好，抑菌率为100.0%(表2)。

表1 120株奶牛乳腺炎病原菌对β-内酰胺类抗生素的敏感性分析[n(%)]

注：R表示耐药，I表示中介，S表示敏感，-表示该菌未进行该项检测；青霉素仅用于测定革兰阳性菌

表2 120株奶牛乳腺炎病原菌对氨基糖苷类抗生素的敏感性分析[n(%)]

注：R表示耐药，I表示中介，S表示敏感，-表示该菌未进行该项检测；链霉素仅用于测定革兰氏阴性菌

2.3病原菌对大环类脂类抗生素红霉素的耐药性分析

参考CLSI抗微生物药物敏感性试验执行标准(2016年版)，测定了66株革兰阳性菌对大环类脂类抗生素红霉素的药物敏感性。研究发现，大部分革兰阳性菌对红霉素的敏感性较好，耐药、中介及敏感的菌株分别占30.3%、9.1%及60.6%；对吉氏库特氏菌、棒状杆菌属细菌的抑菌效果最好，抑菌率为100.0%，对于其他属的受试细菌的敏感率在50.0%左右(表3)。

2.4病原菌对其他类抗生素(四环素和环丙沙星)的耐药性分析

参考CLSI抗微生物药物敏感性试验执行标准(2016年版)，测定了受试菌株对四环素和环丙沙星的药物敏感性。研究发现，大部分受试菌株对四环素的敏感性较好，耐药、中介及敏感的菌株分别占26.7%、7.5%及65.8%；对巨型球菌、棒状杆菌属、芽孢杆菌属细菌的抑菌效果最好，抑菌率为100.0%。受试病原菌对喹诺酮类抗生素环丙沙星的敏感性较好，除阴沟肠杆菌外(50.0%)，大部分菌株的药物敏感性在80.0%以上，可作为奶牛乳腺炎治疗的首选药物(表4)。

表3革兰阳性奶牛乳腺炎病原菌对红霉素的敏感性分析[n(%)]

菌株株数(n)红霉素RIS葡萄球菌属3312(36．4)2(6．0)19(57．6)链球菌属41(25．0)1(25．0)2(50．0)粪肠球菌21(50．0)1(50．0)0(0．0)巨型球菌63(50．0)1(16．7)2(33．3)吉氏库特氏菌90(0．0)0(0．0)9(100．0)棒杆菌属30(0．0)0(0．0)3(100．0)芽孢杆菌属93(33．3)1(11．1)5(55．6)总计6620(30．3)6(9．1)40(60．6)

注：R表示耐药，I表示中介，S表示敏感；红霉素仅用于测定革兰氏阳性菌

表4 120株奶牛乳腺炎病原菌对四环素和环丙沙星的敏感性分析[n(%)]

注：R表示耐药，I表示中介，S表示敏感

2.5不同种属的病原菌对8种抗生素的耐药性分析

不同种属的奶牛乳腺炎病原菌对8种抗菌药物的敏感性不一样。革兰阳性菌中葡萄球菌属病原菌耐药率最高的是青霉素(78.8%)，而对头孢噻吩敏感(100%)；链球菌以对青霉素(75.0%)和四环素(75.0%)的耐药率最高，对头孢噻吩、头孢噻肟和环丙沙星敏感(100.0%)；吉氏库特氏菌除3株菌株对四环素和头孢噻肟表现为中介，对其余所试5种药物均有极强的敏感性，敏感率达100.0%；芽孢杆菌属病原菌对青霉素的耐药率最高(77.8%)，对四环素和庆大霉素敏感率达100.0%。

不同种属的革兰氏阴性奶牛乳腺炎病原菌对8种抗生素的体外药物敏感性也存在差异。实验中分离得到的大肠埃希菌对链霉素的耐药率最高(58.8%)对庆大霉素和环丙沙星敏感(100.0%)；单胞菌属病原菌对链霉素的耐药率最高(75.0%)，耐药率最低的为头孢噻肟(8.3%)；鲁氏不动杆菌对四环素的耐药性最强(54.6%)，最低的为头孢噻肟和环丙沙星，耐药率均为18.2%。研究结果提示，不同种属的病原菌对抗生素的敏感性存在差异，在临床治疗的过程中应根据病原菌的种属进行抗菌药物的选择(表2～4)。

2.6病原菌对8种抗生素的耐药谱分析

比较分析了120株奶牛乳腺炎病原菌对8种抗生素的药物敏感性，8种抗菌药物中耐药率最低的是环丙沙星(8.3%)，敏感率为89.2%；其次为头孢噻吩和头孢噻肟，敏感率分别为76.77%和70.0%；耐药率最高的是青霉素(65.2%)和链霉素(64.8%)。

分析了120株病原菌的耐药谱，发现91株受试菌株为耐药菌株，耐药率为75.8%，其中分离得到的链球菌属、粪肠球菌、巨型球菌、芽孢杆菌属、阴沟肠杆菌、产吲哚金黄杆菌和普通变形杆菌病原菌表现为100.0%耐药。耐药菌以耐受1种(34.0%)和2种抗生素(33.0%)最为常见；出现了部分多重耐药菌(33.0%)，以耐受3种抗生素比例最高(16.5%)；同时发现3株病原菌能够同时耐受5种受试抗生素。进一步分析发现，不同种属奶牛乳腺炎病原菌表现出不同程度的多重耐药现象，所试的链球菌、粪肠球菌、巨型球菌、芽孢杆菌、阴沟肠杆菌以及产吲哚金黄杆菌的耐药情况较为严峻，所试菌株对所试抗生素均表现为耐药，且多为多重耐药菌；分离得到的11株鲁氏不动杆菌中的8株病原菌对所试抗生素出现耐药，5株表现为四重耐药，主要表现为4种抗生素耐药(62.5%)。吉氏库特氏菌属病原菌及弗氏志贺氏菌的药物敏感性较好，对所试抗生素均表现为敏感(表5～6)。

表5 奶牛乳腺炎病原菌对8种抗菌药物的耐药性分析[n(%)]

注：R表示耐药，I表示中介，S表示敏感；红霉素仅用于测定革兰氏阳性菌

表6 奶牛乳腺炎病原菌对8种抗菌药物的多重耐药性分析

注：S表示敏感，I表示中介，R表示耐药

3 讨论

本实验选择了临床常用的青霉素、链霉素、四环素和红霉素；相对用得较少的氨基糖苷类抗生素庆大霉素和喹诺酮类抗生素环丙沙星；以及几乎不用的头孢类抗生素头孢噻吩和头孢噻肟对120株奶牛乳腺炎病原菌进行药物敏感性分析。药敏结果显示，大部分病原菌对受试的8种抗生素产生了不同程度的耐药，其中耐药率最高的是青霉素(65.2%)和链霉素(64.8%)；耐药率最低的是环丙沙星(8.3%)，敏感率为89.2%；其次为头孢噻吩和头孢噻肟，敏感率分别为76.8%和70.0%，实验结果与临床用药情况存在相关性，病原菌对临床常用抗生素的药物敏感性低，对不常用抗生素的药物敏感性较高。青霉素耐药率较高，临床用药时应尽量减少青霉素的使用量，这与国内其它研究者的研究报道一致[4, 14]。红霉素在20世纪80年代因疗效显著常用于治疗奶牛乳腺炎[15]，近年来研究发现全国各地红霉素的耐药率逐年升高，在我们的研究中也发现了红霉素耐药菌株(30.3%)，与国内其它研究相比[4, 14]，其耐药性相对较低，这可能与临床用药情况以及病原菌的地域差异有关。有研究报道喹诺酮类和氨基糖苷类对于治疗奶牛乳腺炎效果较好[4, 14]，我们研究中也发现，喹诺酮类环丙沙星在所有受试药物中的敏感性最好(89.2%)，可用于一些顽固性乳腺炎的治疗；实验中选用的两种氨基糖苷类抗生素链霉素和庆大霉素，庆大霉素的药物敏感性较好，但也已发现耐药菌株的存在，在临床用药上应合理谨慎用药，而链霉素的药物敏感性较差，耐药率为64.8%，可能与该地区长期使用链霉素治疗奶牛乳腺炎有关。此外，研究还发现，不同病原菌对抗生素的敏感性不同，大部分革兰阳性菌对头孢噻吩的敏感性较高，可用于治疗革兰阳性菌引起的奶牛乳腺炎，但粪肠球菌对头孢噻吩100.0%耐药；吉氏库特氏菌对大部分受试药物均敏感，而产吲哚金黄杆菌、链球菌、巨型球菌以及阴沟肠杆菌对大部分受试药物表现为耐药，提示临床用药时，应根据致病菌的类型及药敏试验的结果，合理使用抗生素。

微生物感染引起奶牛乳腺炎是造成奶牛产业巨大经济损失的主要原因[16]，目前仍然主要依靠抗生素治疗奶牛乳腺炎，但抗生素的长期、大量使用，导致病原菌产生了耐药性。实验结果也证明，病原菌对临床常用的几种抗生素的耐药性越来越强。所以合理使用抗生素很有必要[17-19]，在一些顽固性乳腺炎时才使用高效抗生素，严格控制控制用量，减缓耐药菌的产生[20]。

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TheClassificationofthe120StrainsofMastitisEpidemicPathogensinDairyCowsandtheSpectrumAnalysisofTheirDrugResistance

WangXuemei1,GuoHongxia1,GuoLijuan1,LinLin1,2,LiJianlong1,2,DaiMin1,2,SunFenghui1,2Δ
1.SchoolofLaboratoryMedicine,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 2.SichuanProvincialEngineeringLaboratoryforPreventionandControlTechnologyofVeterinaryDrugResidueinAnimal-originFood,Chengdu610500,China

ObjectiveTo classify the epidemic pathogens of mastitis in dairy cows among the cities of Sichuan Province including Chengdu, Meishan and Mianyang and analyze their drug resistance for the purpose of providing the scientific basis for the rational drug use in treating cow mastitis.Methods120 strains of pathogenic bacteria were isolated from the milk of dairy cows suffering from mastitis and the K-B method was used to detect their drug sensitivity to 8 antibiotics including penicillin, streptomycin, tetracycline, erythromycin, gentamicin, quinolones, cefoxitin and cefotaxime.ResultsThe results showed that 91 strains out of the 120 strains were resistant to those antibiotics and the resistance rate was 75.8%. Most of the pathogenic bacteria were resistant to one or two antibiotics, and the resistance rates were 34.0% and 33.0% respectively. There was a certain correlation between the sensitivity of the pathogenic bacteria to the 8 antibiotics and the regularity of clinical use in treating cow mastitis. The pathogenic bacteria were the most resistant to penicillin and streptomycin with the resistance rates of 65.2% and 64.8%, which were followed by the resistance rates to tetracycline and erythromycin, which were 26.7% and 30.3%. The sensitivity to ciprofloxacin was the highest with the rate of 89.2%, which indicated that it was an effective drug in treating cow mastitis.ConclusionStaphylococcus and Escherichia coli are the most common in the pathogenic bacteria isolated from the milk of dairy cows suffering from mastitis. The resistance rate of the pathogenic bacteria are very high and some strains show multidrug resistance, which indicates that the antibiotics should be used rationally to reduce the emergence of drug-resistant strains.

Drug resistance; Dairy cow mastitis; Pathogenic bacteria; Drug sensitivity

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20171023.1006.002.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.05.006

R446.5

A

四川省科技厅应用基础(重点)项目(No:2016JY0014)；四川省省属高校科研创新团队建设计划(No:16TD0027)；四川省科技厅科技支撑计划项目 (No:2016FZ0068)；大学生创新创业训练计划项目(No:201513705059;No:201513705025)

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孙丰慧，E-mail:sunfenghui@cmc.edu.cn