基于荧光免疫层析法建立甲型流感病毒快速检测技术的研究*

常晓松，刘东泽，何 纬，赵书阁，陈肖潇，史 蕾，余华丽，何建伟，樊 强，王志杰△.四川国际旅行卫生保健中心(成都 600)；.四川迈克生物科技股份有限公司(成都 67)；.深圳国际旅行卫生保健中心(深圳 580)；.四川出入境检验检疫局(成都 600)

·论著·

基于荧光免疫层析法建立甲型流感病毒快速检测技术的研究*

常晓松1，刘东泽2，何 纬1，赵书阁2，陈肖潇1，史 蕾3，余华丽4，何建伟4，樊 强4，王志杰4△
1.四川国际旅行卫生保健中心(成都 610041)；2.四川迈克生物科技股份有限公司(成都 611731)；3.深圳国际旅行卫生保健中心(深圳 518033)；4.四川出入境检验检疫局(成都 610041)

目的基于荧光免疫层析技术平台，针对甲型流感病毒抗原，开发甲型流感病毒快速诊断试剂。方法利用荧光微球标记甲型流感病毒单克隆抗体、生物素标记甲型流感病毒单克隆抗体以及包被亲和素和羊抗鼠IgG多克隆抗体的检测卡，构建甲型流感病毒检测体系。通过原料评价、校准曲线、空白限、准确度、线性范围、重复性、热稳定性及临床比对，验证试剂诊断性能。结果本研究得到的荧光免疫层析试剂具有准确度高、检测范围宽、重复性和热稳定性好等优点，其正确率及敏感率均明显高于经典的胶体金试剂。结论本研究应用将为国境口岸或医院的甲型流感病毒快速筛查提供方便、快捷、灵敏的技术手段。

荧光免疫层析技术；甲型流感病毒抗原；快速筛查

荧光免疫层析技术作为近年来新兴的诊断技术，因其操作简便、成本低廉、适宜于快速诊断等优势，在传染性疾病中已得到大量使用[1-3]。荧光免疫层析技术应用于针对特定病原体的检测，荧光微球标记该病原体的单克隆抗体1，生物素标记该病原体的单克隆抗体2，然后按一定比例混合组成反应液[4]。将待测样本与反应液按照一定比例混合，并静置发生免疫反应，形成荧光微球-单克隆抗体1-病原体抗原-单克隆抗体2-生物素的夹心复合物，将夹心复合物滴加在试剂卡加样孔中，夹心复合物中标记单克隆抗体2的生物素与检测线的亲和素结合，过量的荧光微球标记的单克隆抗体1被质控线上的羊抗鼠IgG多克隆抗体捕获。待测样本中的抗原浓度越高，形成的夹心复合物就越多，检测线上被亲和素捕获的荧光免疫复合物的量也就越多，待测样本中抗原的浓度与检测线信号成正相关。通过荧光检测仪，对检测卡进行扫描获得检测信号，根据抗原浓度与荧光检测信号的校准曲线，获得待测样本中病原体抗原的准确浓度，从而具有高特异性、高灵敏度等优势。

本研究利用荧光微球标记甲型流感病毒单克隆抗体、生物素标记甲型流感病毒单克隆抗体以及包被亲和素和羊抗鼠IgG多克隆抗体的检测卡，构建甲型流感病毒检测体系。通过原料评价、校准曲线、空白限、准确度、线性范围、重复性、热稳定性及临床比对，验证试剂诊断性能。同时，与现有的检测技术，如PCR技术及胶体金试剂，进行相应的临床试验比较，进而对本试剂的临床性能进行评价。

1 材料与方法

1.1材料

荧光微球，硝酸纤维素膜，Flu A McAb 1、Flu A McAb 2，羊抗鼠IgG多克隆抗体，链霉亲和素，生物素酯，Flu A 质控品，比对试剂：1)甲型流感病毒检测试剂盒(胶体金法)；2)荧光定量PCR测定。

1.2仪器

干式荧光免疫分析仪(型号：R01，迈克生物股份有限公司)。

1.3临床样本来源

1)广东检验检疫局P3实验室样本：2009年和2013年荧光定量PCR确诊甲型流感临床样本共216例，其中，PCR阳性标本124例，阴性标本92例；2)深圳国际旅行卫生保健中心样本：2016年荧光定量PCR确诊甲型流感临床样本168例，其中，阳性样本118例，阴性样本50例。所有样本均为咽拭子取自口腔上皮细胞，用1.5 mL细胞培养液洗脱备用。

1.4原料验证

采用BCA法测定Flu A NP浓度值；采用SDS-PAGE凝胶电泳法，上样量为5 μg，经过跑样、染色等步骤，最终用凝胶成像系统观察Flu A McAb 及NP的纯度。

1.5甲型流感病毒免疫荧光检测试剂制备及校准曲线

包被NC膜：检测线包被链霉亲和素，质控线包被羊抗鼠IgG多克隆抗体，PVC板贴NC膜、样品垫、吸水纸、组装干燥后切条；梯度稀释Flu A NP质控品，浓度分别为100、50、20、10、5、2、1、 0.5、0 ng/mL，裂解液稀释标记甲型流感病毒单克隆抗体1的微球和标记甲型流感病毒单克隆抗体2的生物素，与各浓度质控品按体积比为4∶1混合，每个浓度平行检测3个检测卡，反应15 min后检测，荧光定量检测仪读取检测线信号值。取3个试纸卡的检测线信号平均值，拟合校准曲线，根据校准曲线拟合浓度值。

1.6免疫荧光层析试纸条检测

加样本25 μL到反应液中，混匀后静置1 min，吸取90 μL混匀后的样本，滴加到测试卡的加样孔中，室温下放置15 min，将测试卡插入免疫荧光检测仪的承载孔中，点击“扫描”，仪器将自动对测试卡进行扫描计算结果。

1.7空白限

1.8准确度

取同一批号试剂检测，选择2 ng/mL的浓度样本作为基质，基质浓度记为A, 按照1∶10比例分别添加1、10、50 ng/mL的Flu A质控品，检测浓度记为C，添加浓度记为B，按照公式：(90×B+10×A)/(100×C)计算回收率。

1.9线性范围

用阴性质控品将接近测定范围上限的高值样本(可在阴性临床样本中添加高值质控品作为高值样本)，按一定比例稀释为50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.195 ng/mL。对每1浓度的样本均重复测定3次，计算其平均值，用线性回归方法计算结果平均值和对应浓度的相关系数r。

1.10重复性

1.11热稳性

取同1批试剂，放置37 ℃条件下做热破坏实验，37 ℃加速10 d后检测，计算测定范围内浓度值变化幅度，计算公式△(0～10 d)/0 d。

1.12临床检测

取同1批试剂，随机抽取临床咽拭子Flu A样本检测，与荧光定量PCR法和甲型流感病毒抗原检测试剂盒(胶体金法)比对。

2 结果

2.1原料验证

BCA法测定Flu A NP浓度是2.5 μg/mL，原料纯度电泳图如下所示，原料纯度均在90%以上，符合要求(图1)。

图1 原料纯度电泳图

2.2基于荧光免疫层析技术的甲型流感病毒检测卡的构建

硝酸纤维素膜上包被有检测线、质控线，检测线固定有亲和素，质控线固定有羊抗鼠IgG多克隆抗体。纸条结构和实物图如下所示(图2～3)。

图2 甲型流感病毒检测试纸条结构图

2.3甲型流感病毒检测试剂标准曲线的确定

每批次试剂调试制备完成后，分别测定不同浓度的Flu A 抗原，以抗原浓度为横坐标，测定信号值为纵坐标，制作校准曲线(图4)

2.4甲型流感病毒检测试剂空白限的确定

每批次试剂分别测定空白样本各20次，计算空白限，空白限均不高于0.1 ng/mL(表1)。

图3 甲型流感病毒检测试纸条实物图

图4 3批试剂校准曲线

表1 3批试剂空白限计算结果

2.5甲型流感病毒检测试纸条准确度

准确度采用添加回收的方式检测，公式如下：

回收率={C×(V0+V)-C0×V0}/(V×Cs)×100%

式中：C: 添加后检测浓度；C0: 添加前样本浓度；V0：添加前样本体积；V: 添加标准液体积；Cs：添加标准液浓度。

计算3批试剂的回收率偏差，回收率偏差均在±15%以内(表2)。

2.6甲型流感病毒检测试剂线性范围

在线性范围0.1～100 ng/mL，3批试剂检测结果线性相关系数R2分别是0.999、0.999、0.999，拟合曲线如下所示(图5)。

表2 回收率计算

图5 线性回归分析图

2.7甲型流感病毒检测试剂重复性

每批次试剂分别测定标示浓度为1.0 ng/mL和10.0 ng/mL的Flu A抗原，计算CV，CV值均在20%以内，说明试剂重复性较好(表3)。

表3 重复性测定结果

2.8甲型流感病毒检测试剂热稳定性

把3批次试剂盒分别放置在37 ℃环境中，10 d后检测，与0 d时信号值比较，计算信号值变化幅度，除空白值以外，其他浓度热破坏前后信号值变化均在±20%，说明试剂热稳定性较好(表4)。

表4 热稳定性测定结果

2.9甲型流感病毒检测试剂临床试验

2.9.1 广东检验检疫局P3实验室样本比对结果 该实验室样本共取124例核酸阳性标本(CT值为12.96～36.94)，92例阴性样本。结果表明，本试剂敏感度是胶体金试剂的2倍多，正确率比胶体金法高，但误诊率有6.52%，数据上看均是在参考值附近的弱阳性,可能与样本本身反复冻融或者样本污染导致(表5)。

表5 广东检验检疫局本试剂与胶体金法性能比较

2.9.2 深圳国际旅行卫生保健中心样本比对结果 该实验室样本共取118例核酸阳性标本(CT值为20.75～38.20)，50例阴性样本。结果表明，本试剂正确率及敏感度均明显高于胶体金法试剂(表6)。

表6 深圳国际旅行卫生保健中心本试剂与胶体金法性能比较

3 讨论

2009年甲流疫情席卷全球，世界银行专家以1968年香港流感和1918年西班牙流感为依据，估计甲流可能导致的全球经济损失，介于全球GDP的0.7%～4.8%，或介于3 840亿美元和26 330亿美元之间[5-7]。甲型流感患者的早期发现对于控制疫情发展具有重要作用[8-9]。

目前，甲型流感病毒的确认一般采用鸡胚或MDCK细胞分离培养和血凝抑制法，操作繁琐且费时费力，难以满足快速诊断需要[10-12]。随着快速诊断技术的发展和应用，目前市场上甲型流感产品类型基本可以分为3大类：核酸诊断类(RT-PCR法)、酶联免疫吸附法(ELISA法)和胶体金免疫层析法。RT-PCR法准确度最高，是确诊的首选方法，但检测成本较高，检测时间较长[13-14]；ELISA法是医院检验科和疾控系统实验室的经典方法[15-16]；胶体金法速度最快，简便易行，适合于普遍筛查[17-18]。目前，国境口岸快速筛查技术主要为胶体金技术，但由于胶体金检测的灵敏度限制，导致较多的甲型流感病例漏检[19]，不利于对甲流疫情的防控。

本项目开发的甲型流感病毒检测试剂盒，采用免疫荧光层析技术，相对于胶体金技术，具有灵敏度高、特异性强等优点。通过本次验证发现，免疫荧光层析检测方法在操作的便利性方面与常规使用的胶体金检测方法差异不大，样本处理加检测时间均控制在15 min以内，但正确率和敏感率均明显优于胶体金方法，阳性样品的阳性显示较为客观、明显，易于判断，阳性检出率优于胶体金检测方法，是一种新型的较为准确、灵敏度较高的快速检测方法。在甲型流感爆发期，可以在口岸快速检测流感样患者，筛查可疑人群，防止疫情蔓延和扩大，且相对于胶体金法，在检测敏感度上得到很大提高，降低了漏诊风险；在非疫情爆发时期，亦可广泛应用于医院临床、科研机构、卫生防疫部门、学校、医院、大型运动会、展览会等人员聚集场所。该技术已申请并授权实用新型专利，其后期应用转化具有很好的市场前景。

[1]Hu Z, Zhao M, Qu Y,etal. In Vivo 3-Dimensional Radiopharmaceutical-Excited Fluorescence Tomography[J]. J Nucl Med, 2017, 58(1): 169-174.

[2]李军涛, 候水平, 姬泽薇, 等. 免疫荧光层析试纸条法检测食用油中的黄曲霉毒素B1[J]. 中国卫生检验杂志, 2015, 25(7): 963-965.

[3]Parfitt G J, Kavianpour B, Wu K L,etal. Immunofluorescence Tomography of Mouse Ocular Surface Epithelial Stem Cells and Their Niche Microenvironment[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2015, 56(12): 7338-7344.

[4]Yan D, Deng C, He Y,etal. Sensitive Naked Eye and Autofluorescence Detection of Cu(2+) in Biological Fluids by Polyethyleneimine Microspheres[J]. J Fluoresc, 2016, 26(5): 1763-1772.

[5]Peiris J S, Poon L L, Guan Y.Emergence of a novel swine-origin influenza A virus (S-OIV) H1N1 virus in humans[J]. J Clin Virol. 2009，45(3):169-173.

[6]Olsen B, Munster V J, Wallensten A,etal. Global patterns of influenza a virus in wild birds[J]. Science, 2006, 312(5772): 384-388.

[7]Tong S, Li Y, Rivailler P,etal. A distinct lineage of influenza A virus from bats[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(11): 4269-4274.

[8]Rambaut A, Pybus O G, Nelson M I,etal. The genomic and epidemiological dynamics of human influenza A virus[J]. Nature, 2008, 453(7195): 615-619.

[9]Allen I C, Scull M A, Moore C B,etal. The NLRP3 inflammasome mediates in vivo innate immunity to influenza A virus through recognition of viral RNA[J]. Immunity, 2009, 30(4): 556-565.

[10] Lin S C, Kappes M A, Chen M C,etal. Distinct susceptibility and applicability of MDCK derivatives for influenza virus research[J]. PLoS One, 2017, 12(2): e0172299.

[11] Feldmann A, Schafer M K, Garten W,etal. Targeted infection of endothelial cells by avian influenza virus A/FPV/Rostock/34 (H7N1) in chicken embryos[J]. J Virol, 2000, 74(17): 8018-8027.

[12] Meijer A, Bosman A, van de Kamp E E,etal. Measurement of antibodies to avian influenza virus A(H7N7) in humans by hemagglutination inhibition test[J]. J Virol Methods, 2006, 132(1/2): 113-120.

[13] Spackman E, Senne D A, Myers T J,etal. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes[J]. J Clin Microbiol, 2002, 40(9): 3256-3260.

[14] Payungporn S, Chutinimitkul S, Chaisingh A,etal. Single step multiplex real-time RT-PCR for H5N1 influenza A virus detection[J]. J Virol Methods, 2006, 131(2): 143-147.

[15] Starick E, Werner O, Schirrmeier H,etal. Establishment of a competitive ELISA (cELISA) system for the detection of influenza A virus nucleoprotein antibodies and its application to field sera from different species[J]. J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health, 2006, 53(8): 370-375.

[16] Olson Z F, Sandbulte M R, Souza C K,etal. Factors affecting induction of peripheral IFN-γ recall response to influenza A virus vaccination in pigs[J]. Vet Immunol Immunopathol, 2017, 185: 57-65.

[17] 张德玺, 韩洪彦, 王希良. 一种快速检测甲型流感病毒的方法[J]. 中国比较医学杂志, 2007, 17(1): 42-45.

[18] 徐礼锋,余旭良,张峰,等. 液体分枝杆菌培养管培养联合结核分枝杆菌分泌蛋白64免疫胶体金检测法在快速鉴定结核分枝杆菌中的应用[J]. 中国卫生检验杂志,2017,27(4):495-497.

[19] You F, Liwen J U, Zhang J,etal. Research on the specificity and sensitivity of rapid detection methods of influenza virus[J]. Laboratory Medicine, 2009, 64(5):696-704.

AStudyontheRapidDetectionTechnologyofInfluenzaAVirusBasedonFluorescenceImmunochromatography

ChangXiaosong1,LiuDongze2,HeWei1,ZhaoShuge2,ChenXiaoxiao1,ShiLei3,YuHuali4,HeJianwei4,FanQiang4,WangZhijie4△.
1.SichuanInternationalTravelHealthCareCenter,Chengdu610041,China; 2.SichuanMaccuraBiotechnologyCompanyLimited,Chengdu611731,China; 3.ShenzhenInternationalTravelHealthCareCenter,Shenzhen518033,China; 4.SichuanEntry-exitInspectionandQuarantineBureau,Chengdu610041,China

ObjectiveTo develop a rapid diagnostic kit for influenza A virus based on the platform of fluorescence immunochromatography.MethodsThe detection system for influenza A virus was constructed by using the fluorescent microsphere to label the influenza A virus monoclonal antibody, the biotin to label monoclonal antibody against influenza A virus, and the assaying card to detect the coated avidin and the goat-anti-mouse IgG polyclonal antibody. The diagnostic performance was validated by detecting the raw materials of the test strip, calibration curve, blank limit, accuracy, measurement range, repeatability and thermal stability and comparing the results of the clinical trials.ResultsThe fluorescence immunochromatographic strip obtained in the study has the advantages of high accuracy, wide measurement range and good repeatability and thermal stability, and its accuracy and sensitivity are significantly higher than those of immunochromatogragphic assay.ConclusionThe technology will provide a convenient, quick and sensitive diagnostic reagent for the rapid screening of influenza A virus in the frontier port or hospital.

Fluorescence immunochromatography; Influenza A virus; Rapid screening

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20171009.1550.004.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.05.004

R446.5

A

四川省科技支撑计划(No:2014SZ0032)；质检公益性行业科研专项(No:201210046)

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王志杰， E-mail：867523466@qq.com