苯基衍生化气相色谱-质谱联用测定尿样中氰离子

李 想 朱 昱 夏鑫鑫 宋 辉 伊魁宇

（中国刑事警察学院法化学系 辽宁 沈阳 110035）

苯基衍生化气相色谱-质谱联用测定尿样中氰离子

李 想 朱 昱 夏鑫鑫 宋 辉 伊魁宇

（中国刑事警察学院法化学系 辽宁 沈阳 110035）

建立尿中氰离子的衍生化气相色谱-质谱联用测定方法。通过苯胺与亚硝酸盐生成的重氮盐与氰离子发生反应，衍生物用GC/MS/MS进行检测。优化了衍生化温度和时间、催化剂用量、衍生化试剂的用量等衍生化条件。在最佳条件下，氰离子衍生物稳定且色谱峰形良好，在0.1～10μg/mL范围内，检出限为0.030μg/mL，测量限为0.10μg/mL，相对标准偏差为4.61%，相对回收率为96.12%。该方法回收率高，专属性好，可用于尿中氰离子的定量测定。

苯胺 衍生化 GC/MS/MS 氰离子

1 引言

氰化物在工业中使用很广泛，经常发生职业性氰化物中毒的情况。在社会上也有用氰化物自杀或他杀的情况。氰化物因其所具有的剧毒性，在刑事毒物案件的分析中受到高度重视，致死原因主要是通过氰化物进入人体后所释放出的氰基（CN-）与人体内的细胞色素氧化酶中的三价铁进行结合，使得细胞传递氧的功能丧失，最终导致机体的缺氧死亡。氰化物中毒案件的高发性和高致命性使其定量定性分析在司法鉴定中具有非常重要的意义。

近年来，人们将科学研究的重点放在高效样品前处理技术与灵敏的检测手段相结合方面，促使分析生物检材中氰化物的检测有了很大的进展，并且极大地提高了氰化物定性定量分析的灵敏度和专属性。色谱法[1-6]等新型技术手段逐步取代了传统的检测方法，如分光光度法[7]、硝酸银滴定法[8]等。对于生物检材中的氰化物分析主要是通过将其衍生化为大分子物质后再进行定性定量分析，在此过程中发展出多种衍生化试剂，同时应用高灵敏的检测技术，使生物检材中痕量甚至超痕量氰化物的检测分析得以实现。

目前对于氰离子检测的色谱方法有许多，包括离子色谱法[1]69-71、气相色谱、气相色谱质谱联用[3-4]、液相色谱法[5]587-589、液相色谱质谱联用[6]143-147等方法。离子色谱法共存离子干扰大，易受内源杂质干扰。衍生化顶空气相色谱法[2]39-43是目前分析氰化物的一种较为常用的气相色谱分析方法，使用电子捕获器进行检测，虽然灵敏度高，但定性分析特异性差。衍生化顶空GC/MS方法[4]31-34，使用五氟苄基溴做衍生化试剂，衍生化效率低，容易出现内源性杂质的干扰。液相色谱法、液相色谱质谱联用使用衍生化方法，但衍生产物在生物检材中稳定性不佳，重现性不好。本文采用衍生化气相色谱-质谱联用方法检测尿液中的氰离子，由于氰离子检测易受内源杂质干扰，经过衍生化气相色谱-质谱联用方法可有效提高检测专属性，衍生物稳定性好。

2 实验方法

2.1 仪器与试剂

Finnigan PolarisQ气相色谱/质谱联用仪；高速离心机；涡旋混合器。苯胺购置于沈阳市试剂一厂，纯度大于99.5%；氯代苄、盐酸、亚硝酸钠、硫酸铜均购置于国药集团试剂有限公司，分析纯；氰离子标准溶液购置于北京坛墨质检科技有限公司，浓度为100μg/mL。

2.2 溶液配制

尿液中添加氰离子标准溶液配制成标准添加尿样，取100μg/mL氰离子标准溶液10mL用尿液稀释至100mL；用甲醇配制成浓度为1.0mg/mL的氯代苄溶液；用环己烷配制成浓度为0.15mol/mL的苯胺溶液；用水配制成浓度为50mg/mL的亚硝酸钠溶液；用水配制成浓度为0.1mol/L的硫酸铜溶液；用水配制成浓度为1mol/L的盐酸溶液。

2.3 样品制备

取尿样1mL，加5μL氯代苄溶液，涡旋离心。加入0.25mL苯胺衍生化试剂，0.5mL亚硝酸钠溶液，0.1mL硫酸铜溶液，以0.05mL盐酸溶液，涡旋混合1min。放入50℃水浴锅中加热15min。将溶液涡旋后离心，取上清液1μL，备检。

2.4 GC-MS条件

GC条件：DB-5MS毛细管色谱柱（30m×0.25mm×0.25μm）；载气为高纯氦气，流速为1.0mL/min；进样口温度为280℃。色谱柱升温程序：初始柱温为60℃，保持1min，以20℃/min升至80℃，再以5℃/min升至95℃，最后以20℃/min升至280℃。

MS条件：溶剂延迟3min；一级质谱扫描范围50～200amu；电子轰击源能量70eV；传输线温度280℃；离子源温度200℃。

3 结果与讨论

3.1 质谱定性分析

由于氰离子无法直接提取至有机相中，需将水性样品基质中氰离子衍生化成有机物后进行分析。将苯胺与亚硝酸钠反应生成重氮盐，再与氰离子发生亲核取代反应，生成衍生化产物苯甲腈。氰离子的衍生化反应式如图1所示。

图1 氰离子衍生化反应式

衍生化产物苯甲腈及内标物氯代苄用GC/MS/MS进行分析的二级质谱总离子流色谱图和质谱图如图2和图3所示。从图2中可以看出苯甲腈和氯代苄的峰形良好，保留时间分别为4.83min和5.3min。苯甲腈和氯代苄的二级质谱特征离子峰分别为76m/z和65m/z。可结合二级质谱特征离子峰及保留时间进行分析。

图2 苯甲腈和氯代苄的二级质谱总离子流图

图3 苯甲腈和氯代苄的二级质谱图

3.2 衍生化条件的选择

3.2.1 衍生化温度和时间

较高的反应温度、较长的衍生化时间有利于衍生化完全进行。为考察衍生化温度和时间对反应产率所产生的影响，移取10μg/mL氰离子的尿样标准溶液1mL，按照2.3项进行实验，分别对反应温度和时间进行考察。实验研究表明本衍生化反应在50℃水浴时，衍生化反应速度适中，反应完全。如继续升高反应温度则反应剧烈，不易控制反应进程。当反应温度为50℃时考察衍生化时间，发现时间超过15min，苯甲腈与氯代苄的色谱峰面积之比不随时间延长变化。因此选择苯基衍生化反应温度为50℃水浴，反应时间为15min。

3.2.2 催化剂用量

催化剂用量要适量，用量不足，反应进行过慢，或无法达到衍生化要求；用量过大，会有少部分催化剂进入有机相，影响检测结果。为了考察催化剂用量对反应产率所产生的影响，移取10μg/mL氰离子的尿样标准溶液1mL，按照2.3项中方法分别加入0.02mL、0.1mL、0.2mL的硫酸铜溶液，衍生化后进行GC/MS/MS测定。结果表明：当硫酸铜溶液用量为0.1mL时，衍生化反应完全，试剂用量超过0.1mL时，响应值基本不变，但谱图中杂质峰增加。综合考虑，本实验硫酸铜溶液用量为0.1mL。

3.2.3 衍生化试剂用量

取1 mL 10μg/mL氰离子的尿样标准溶液3份，按2.3项中方法分别加入0.1mL、0.25mL、0.5mL的苯胺溶液，衍生化后进行GC/MS/MS测定。结果表明：当苯胺溶液用量为0.25mL时，衍生化反应完全，试剂用量超过0.25mL时，响应值基本不变，但谱图中杂质峰增加。综合考虑，本实验苯胺溶液用量为0.25mL。

3.3 线性范围和检出限

取1mL空白尿样添加氰离子0.1μg，按照2.3项方法进行分析，根据S/N=3∶1确定方法检出限为0.030μg/mL，根据S/N=10∶1确定方法测量限为0.10μg/mL。取6份1 mL空白尿样，分别添加氰离子，添加量各为0.1μg、0.5μg、2μg、5μg、8μg、10μg，上述溶液中加入氯代苄5μL，按照2.3项方法进行分析，以苯甲腈和氯代苄色谱峰面积比值（Y）和氰离子浓度与氯代苄浓度比值（X）做线性回归，得到方法标准曲线的回归方程为Y=1.47X-0.02，γ=0.9983。

3.4 回收率和精密度

在0.1～10μg/mL的线性范围内采用氰离子加标的方法进行回收实验，分别添加0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL 3个水平的氰离子标准溶液，每个加标尿样平行测定6次。结果表明，不同加标尿样平均回收率分别为94.34%、95.92%和98.08%，相对标准偏差均小于4.16%。

3.5 实际样品测定

对作者所在单位受理的1起氰化物案件，用本文实验方法进行测定，得到案件样本的二级质谱总离子流图，如图4所示，谱图显示在实际案件中无干扰物质的影响。尿样中检出氰离子成分，其含量为5.6μg/mL；说明本方法在尿样分析中是可行的，能够满足尿样中氰离子的检测要求。

图4 案件样本中苯甲腈和氯代苄的二级质谱总离子流图

4 结论

由于氰化物中毒案件中的送检检材多数为生物检材，生物检材的特点是组分复杂且杂质干扰较大。因此，使用传统的检测方法测定氰离子时不能将目标物从复杂基质中分离提取出来，从而达到分离分析的目的。同时，对氰化物进行定性分析时特异性较差，并且由于生物检材中复杂基质的干扰易使检验结果出现假阳性，使分析结果的准确度降低。

本文所采用的衍生化方法，建立了尿样中氰离子的检测手段。利用该衍生化方法，有效减少了尿样中杂质的干扰，提高了氰离子检测的专属性和灵敏度。通过对案件尿液样品的分析实验，证明了方法的可行性和实用性，为尿样中氰离子的检测手段提供了新的检测方法。

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O657.63

A

2095-7939（2017）05-0083-03

10.14060/j.issn.2095-7939.2017.05.016

2017-05-09

李想（1987-），女，山东蓬莱人，中国刑事警察学院法化学系助理实验师，主要从事毒品毒物检验研究。

（责任编辑：孟凡骞）