IL-23和MMP-9在非急性硬膜下血肿形成时间推断中的法医学研究

杜 宇 单 迪 贾儒林 郑吉龙

（中国刑事警察学院法医学系 辽宁 沈阳 110035）

IL-23和MMP-9在非急性硬膜下血肿形成时间推断中的法医学研究

杜 宇 单 迪 贾儒林 郑吉龙

（中国刑事警察学院法医学系 辽宁 沈阳 110035）

检测白介素-23（IL-23）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）在非急性硬膜下血肿中的表达及其在推断非急性硬膜下血肿形成时间中的法医学意义。选择符合条件的非急性硬膜下血肿临床病例30例，根据影像学首次检出血肿至钻孔引流术的时间间隔分为7～14d（A）、15～21d（B）、22d以上（C）三组。10例健康体检者被作为对照组。采集硬膜下血肿患者的血肿液、外周血及健康对照组的外周血，应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测不同时间组血肿液及外周血中IL-23和MMP-9含量。与健康体检者外周血相比较，血肿内IL-23，MMP-9含量均显著增高。随血肿形成时间增加，血肿内IL-23含量逐渐降低，MMP-9含量逐渐增高，各时间组之间差异显著（P＜0.01）。血肿患者外周血IL-23、MMP-9含量增高，但各组间差异不明显。血肿内IL-23和MMP-9的含量在一定时间段内呈现时序性变化规律，可应用于硬膜下血肿形成时间推断。

非急性硬膜下血肿 血肿形成时间 白细胞介素-23 基质金属蛋白酶-9

1 引言

硬膜下血肿是常见的颅内血肿，多由外伤造成。根据临床起病缓急，硬膜下血肿分为急性、亚急性及慢性，伤后3～21天出现症状者为亚急性，21天以上出现症状为慢性。亚急性和慢性硬膜下血肿（以下统称为非急性硬膜下血肿）于外伤后一段时间才呈现相应症状，因此，与外伤之间的关联性成为法医鉴定的难点问题。推断非急性硬膜下血肿形成时间有助于分析血肿成因，但是目前尚没有关于非急性硬膜下血肿形成时间推断的相关报道。

研究证实，局部炎症反应，血肿外膜新生血管生成及再出血是非急性硬膜下血肿发生、发展的重要机制[1-5]。本研究选择与炎症反应和新生血管生成密切相关的白细胞介素-23（interleukin-23，IL-23）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）作为观察对象，检测这两种细胞因子在非急性硬膜下血肿液中的表达及含量变化，探讨利用细胞因子推断硬膜下血肿形成时间的可行性。

2 材料与方法

2.1 研究对象及分组

选取2014年9月至2016年9月间符合条件的非急性硬膜下血肿住院患者30例（男26例，女4例）；年龄46～73岁，平均（64.5±7.3）岁；23例有明确外伤史；6例伴有颅骨骨折。

其中，纳入病例需符合以下条件：影像学检查初次发现血肿时，血肿量估算不超过10mL，神经系统症状无或轻微，依据临床症状及CT或MRI检验结果的变化证实血肿为慢性进程，随病程发展，患者神经系统症状逐渐加重，所有病例均为单侧幕上血肿，全部采取局麻下颅骨钻孔冲洗引流术抽取血肿，术前估算血肿量范围50～100mL；初次检出血肿后超过3d出现神经系统症状，超过7d行颅骨钻孔冲洗引流术；患者术前60d内无急慢性感染性疾病史，术前凝血功能检测正常，颅脑以外器官及组织无轻伤（含）以上程度损伤。

分组：纳入患者初次发现血肿至手术之间的时间间隔不同，最短7d，最长64d，平均（31±7）d。依据血肿形成时间不同分为3组：7～14d血肿组（A组，9例）；15～21d血肿组（B组，8例）；22d以上血肿组（C组，13例）。

2.2 检材采集

所有病例均在局麻下行颅骨钻孔冲洗引流术，术中收集未冲洗前抽出的血肿液10mL和患者静脉血3mL备检。同年龄段的10名志愿者（8男，2女，凝血功能正常，近期无感染性疾病史）分别空腹抽取静脉血3mL作为健康外周血对照组。所采静脉血均置于3.2%枸椽酸钠抗凝（1∶9）真空采血管，血肿液置于干燥试管，3000r/min离心10min（离心半径4cm），分离出血清或上清液。全部检材-80℃冰箱低温保存备检。（本研究符合患者所在医院人体试验委员会所制定的伦理学标准，得到批准予以实施，并与患者家属及自愿者签署实验知情同意书。）

2.3 检测方法

应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血肿液及静脉血中IL-23和MMP-9含量。IL-23 ELISA kit购自广州威佳科技有限公司，Human MMP-9 PicoKineTMELISA Kit 试剂盒购自博士德生物工程有限公司，各步骤均依照仪器和ELISA检测试剂盒说明书要求进行操作。冻存的上清液样本室温溶解后，将待测样品加入不同抗体包被的96孔板，加入反应缓冲液后37℃封闭40min，洗涤后添加酶标抗体，37℃孵育40min，TMB底物显色后，加入硫酸终止反应。应用意大利SD11/XT-96MB酶标仪检测OD值，绘制标准曲线，计算出IL-23、MMP-9表达水平，单位为pg/mL。

2.4 统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件分析，结果用均数±标准差（x±s）表示；采用t检验；以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

与健康志愿者和同组患者外周血比较，血肿内IL-23含量显著提高。随血肿形成时间延长，IL-23含量逐渐下降，在7～14天血肿组（A组）含量最高，15～21天血肿组（B组）降低，22天以上血肿组（C组）最低，如图1所示，分别是同组患者外周血内IL-23含量的40.1倍、29.4倍和23.0倍，不同时间组之间差异显著（P＜0.01）。与健康志愿者外周血内IL-23含量相比较，各组血肿患者外周血IL-23含量虽明显增高（P＜0.05），但组间差异不明显（P＞0.05）。

图1 非急性硬膜下血肿患者血肿液和外周血内IL-23含量变化（pg/mL， x±s）

图2 非急性硬膜下血肿患者血肿液MMP-9含量变化（pg/mL， x±s）

与健康志愿者和同组患者外周血比较，血肿内MMP-9含量显著提高，不同时间组之间差异显著（P＜0.01）。随血肿形成时间延长MMP-9含量逐渐增加，7～14天血肿组（A组）含量最低，15～21天血肿组（B组）开始增高，22天以上血肿组（C组）最高，如图2所示，分别是同组患者外周血内MMP-9含量的25.4倍、54.0倍和71.9倍。与健康志愿者外周血内IL-23含量相比较，各组血肿患者外周血MMP-9含量虽明显增高（P＜0.05），但组间差异不明显（P＞0.05）。血肿和静脉血内IL-23和MMP-9含量变化如表所示。

表 非急性硬膜下血肿患者血肿液和外周血内IL-23和MMP-9含量变化（pg/mL， x±s）

4 讨 论

损伤时间推断是法庭科学研究的热点和难点问题。目前，皮肤、肌肉等软组织损伤形成时间的推断已经取得了关键性进展，硬膜下血肿形成时间推断仍缺乏有效方法，导致硬膜下血肿与争议外伤之间是否存在关联成为法医学鉴定中的疑难问题。寻找硬膜下血肿形成时间推断的灵敏指标，建立标准化的形成时间推断方法具有现实的法医学实践意义。

炎症反应、新生血管生成是创伤或疾病发展过程中必不可少的病理过程，与炎症反应、新生血管生成密切相关的细胞因子越来越多的被应用于损伤时间推断[6-8]。研究证实，局部炎症反应、新生血管的形成及再出血可能是慢性硬膜下血肿发生、发展的重要机制，与之相关联的细胞因子在慢性硬膜下血肿内高表达已经被证实[9-11]，但表达是否呈现时序性仍属未知。炎症反应和新生血管生成分别在损伤后的不同时段占优势，因此，我们设想促炎性和促血管生成的细胞因子在硬膜下血肿发展的不同时程内发挥作用，可能具有时序性表达规律，可作为血肿形成时间推断的指标。

IL-23是具有显著促炎作用的细胞因子，与许多疾病组织炎症的发生密切相关，在多种损伤和疾病的炎症反应阶段发挥作用[12]，但在法医学损伤时间推断方面目前尚未见相关报道。MMP-9为明胶酶，主要由单核及巨噬细胞等炎性细胞分泌，可降解明胶和Ⅳ型胶原，对纤维结合素、弹性蛋白也有降解作用，通过降解细胞外基质减低血管生成的阻力， 并通过活化和释放血管生成因子而促进血管的生成。李小林等通过大鼠脑损伤模型的免疫组化染色，发现脑损伤后MMP-9呈现时序性规律表达，可用于脑损伤时间推断[13]。李刚莲等通过大鼠皮肤切创模型发现MMP-9在皮肤损伤组织内的表达具有良好的时间相关性，可成为皮肤损伤时间推断的指标[14]。MMP-9已经成为损伤时间推断的研究热点，但在硬膜下血肿形成时间推断方面尚未发现相关研究报道。酶联免疫吸附（ELISA）技术的检测结果较之HE染色、免疫组化、原位杂交等法医学传统的形态学观察方法具有更高的灵敏度和准确性，已经成为研究创伤、疾病等病理过程中关键性细胞因子含量变化的重要技术手段。

本实验分别检测非急性硬膜下血肿及外周静脉血中IL-23和MMP-9含量的变化。结果显示，与健康志愿者和同组患者的外周血比较，硬膜下血肿患者血肿内IL-23、MMP-9的含量均显著提高，提示新生血管生成和局部炎症反应是非急性硬膜下血肿的发生、发展的重要机制，而IL-23、MMP-9可能是相关病理进程中的关键性细胞因子。

随血肿形成时间延长IL-23含量逐渐下降，7～14d血肿组含量最高，15～21d血肿组降低，22d以上血肿组最低，分别是同组患者外周血内IL-23含量的40.1倍、29.4倍和23.0倍，不同时间组之间差异显著（P＜0.01）。与之相反，血肿内MMP-9含量随血肿时间延长而逐渐增加，分别是同组患者外周血内MMP-9含量的25.4倍、54.0倍和71.9倍，各时间组之间同样差异显著（P＜0.01）。IL-23和MMP-9随血肿形成时间而呈现的时序性变化规律为硬膜下血肿形成时间推断提供了可能。同时，IL-23、MMP-9含量的不同变化规律提示IL-23可能在硬膜下血肿发生和发展的早期发挥作用，而MMP-9在非急性硬膜下血肿发展的中晚期起作用。

本实验中，血肿患者与健康自愿者外周血相比较，IL-23，MMP-9含量亦显著增高（P＜0.05），但各时间组之间无统计学差异（P＞0.05），这提示细胞因子全身性的含量变化尚无法应用于损伤时间推断，而创伤局部组织内细胞因子的变化更具有法医学意义。

与皮肤损伤、颅脑损伤时间推断中动物建模不同，由于血肿量无法人为控制，统一的外伤性硬膜下血肿动物模型建立尚无法实现，因此符合实验构想的临床病例样本和检材的收集成为本研究的关键。本实验在检材收集过程中尽量避免各种可能的干扰因素，力求实验样本的标准、统一。我们将初次发现血肿至手术之间的时间间隔假定为血肿形成时间，并据此分组，而对于血肿发生至初次检出之间的时间尚无法评估。本研究首次尝试通过血肿内细胞因子的含量变化推断硬膜下血肿形成时间，实验结果高度提示具有进一步研究的价值，将更多的细胞因子纳入检测范围，提高时间分组的精确度将成为今后研究工作的重点。

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D919

A

2095-7939（2017）05-0086-04

10.14060/j.issn.2095-7939.2017.05.017

2017-05-09

公安部技术研究计划项目（编号：2014JSYJB013）。

杜宇（1977-），男，山东新泰人，中国刑事警察学院法医学系副教授，博士，主要从事法医病理学研究。

（责任编辑：孟凡骞）