高效液相色谱-三重四极杆质谱联用法检测血清中合成大麻素JWH-203

徐秀明

（辽宁警察学院刑事技术系 辽宁 大连 116036）

高效液相色谱-三重四极杆质谱联用法检测血清中合成大麻素JWH-203

徐秀明

（辽宁警察学院刑事技术系 辽宁 大连 116036）

通过筛选选择性的SPE材料，优化SPE条件，建立了血清中合成大麻素JWH-203的固相萃取-液相色谱-电喷雾三重四极杆质谱检测方法，血清中JWH-203浓度在4ng/mL～200ng/mL范围具有良好的线性关系，最低检出限为0.2ng/mL。日内相对标准偏差（RSD）小于3.5%，日间RSD小于8.6%，空白添加法测定方法的回收率为97%～103%，并考察了该方法的基质效应和处理效率。该方法可为法庭科学中血液样品中JWH-203的检验鉴定提供技术支持。

液质联用 新精神活性物质 合成大麻素 JWH-203 “香料”类毒品

1 引言

“香料”类毒品是自2004年开始销售于欧洲的便利店或网上商店，2008年开始在世界各国流行的一种新型毒品[1]，其主要成分是合成大麻素类化合物，这是一大类模拟天然大麻的主要活性成分四氢大麻酚而合成的一类化合物，它们与四氢大麻酚具有相似的药理与生理作用，都是大麻素受体（CB1和/或CB2）的受体激动剂[2-3]。“香料”类毒品是将一种或几种合成大麻素溶解于有机溶剂中，然后喷洒在香料或药草上，干燥后形成的。该类毒品通常被冠以“无成瘾性”、“草本兴奋剂”、“合法兴奋剂”、“合法嗨药”等欺骗性的名称，使人在好奇心的趋使下服用此类毒品[4]。商品名称以“K2”或“Spice”著称，另有Genie（精灵）、Zohai（佐海）、音乐小草等。实际上，其成瘾性与大麻类似，作用于人体中枢神经系统，引发兴奋、致幻等，效果是大麻的4-5倍[3]。这些合成大麻素种类很多，有萘甲酰吲哚类（JWH-018，JWH-073，JWH-210，JWH-015等）、苯乙酰吲哚类（JWH-203，JWH-250）、环己基苯酚类（CP-47，497，CP-47，497-C8等），以及大麻酚经典结构（HU-210）等多种结构类型，通常是根据发明者的姓名、发明时间及化合物结构，分别被编号为不同系列的代码[5]。联合国毒品与犯罪问题办公室（UNODC）在2016年世界毒品报告《World Drug Report 2016》中指出，2015年中UNODC成员国监测到了21种新的合成大麻素类化合物，主要滥用人群是青少年，这些香料类的毒品一般是卷成香烟或以烟斗的形式，通过燃烧吸食。目前，我国尚没有对合成大麻素类物质的整体滥用情况开展监测，整体滥用情况还不清楚，但辽宁、北京、浙江等地的公安机关在查获的植物碎叶或花瓣样品中都检出了合成大麻素，主要是90后人群在娱乐场所中滥用。

JWH-203是一种苯乙酰吲哚类的合成大麻素，是由John W. Huffman合成并命名的，中文名称为1-戊基-3-（2-氯苯乙酰基）吲哚，英文名为2-（2-Chlorophenyl）-1-（1-pentyl-1H-indol-3-yl）ethanone。2010年10月29日，欧洲毒品和毒品成瘾检测中心（European Monitoring Centre of Drugs and Drug Abuse，EMCDDA）的早期预警系统（Early Warning System，EWS）首次报道了这种新型合成大麻素，由拉脱维亚的有机合成机构鉴定出了这种合成大麻素，并且是来自中国的1.8公斤JWH-018的粉末。2016年2月，国家禁毒委员会办公室发布的《2015年中国毒品形势报告》中指出：包括合成大麻素在内的新精神活性物质是通过国外订单的形式在中国生产的。在2015年10月，我国已将JWH-203列入管制药品目录。Huffman研究了JWH-203的药理活性，该化合物与大麻素受体CB1和CB2都具有很强的作用能力[6]。合成大麻素类物质的检测方法主要有气质联用法[7-8]、液相色谱法[9-10]、液质联用法[11-13]、超临界流体色谱法[14]等。关于JWH-203检测的文献报道较少，主要是针对固体粉末和“香料”草本植物中该合成大麻素的检测[15]，生物检材中JWH-203的检测仅Kneisel S等报道了采用液液萃取-液质联用法检测血液中合成大麻素JWH-203，方法回收率低，仅为54.7%[16]。本文通过优化筛选固相萃取材料，建立了血清中JWH-203检测的SPE-LC-MS/MS方法，大大提高了回收率，有效去除了蛋白质对检测的干扰，提高了检测灵敏度。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Agilent液质联用仪（Agilent 1200 infinity LC系统，配有电喷雾离子源的Agilent 6460 Triple Quadrupole质谱系统），0.1mg电子天平，Millipore Simplicity纯水制备系统。

标准品JWH-203，纯度大于98%，购于美国Cato公司。甲醇为色谱纯（Oceanpark），所用水为超纯水。

2.2 样品溶液的制备

标准溶液的配置：使用分析天平准确称取JWH-203的标准物质粉末1mg，用甲醇定容于5mL容量瓶中，得到浓度为200μg/mL的储备液，储存于冰箱（-20℃）中备用。

校准溶液的制备：向500μL不含药物的血清中添加10μL适量浓度的标准溶液，配制成JWH-203浓度分别为4、10、40、100和200 ng/mL系列溶液作为校准溶液。

质控样品的制备：向500μL不含药物的血清中添加适量的标准溶液，配制成低、中、高3个浓度的质控样品，JWH-203浓度分别为4、40和200ng/mL。

2.3 样品处理

血清样品（添加药物JWH-203及空白血清）的处理采用固相萃取（SPE）方法，实验用SPE柱为华谱60-C18 HCE 100mg柱，500μL血清样品中加入1.5mL超纯水稀释后，加入2mL甲醇，涡旋5min，超声15min，离心20min（4200r/min），上清液作为SPE上样液。SPE条件：活化（2mL甲醇），平衡（1mL 50%甲醇-水），上样（4mL离心处理的上清液），淋洗（0.5mL 50%甲醇-水），洗脱（1mL 80%乙腈-水，洗脱液含0.2%甲酸）。洗脱液经过40℃氮吹，干燥后，100μL甲醇复溶，以备LC-MS分析。

2.4 仪器条件

LC条件色谱柱：华谱C18（2.1×50mm，3μm），柱温30℃；流动相：甲醇-水，流速0.2mL/min，初始时甲醇的体积分数为80%，保持3.5min，3.5min至5.5min内，甲醇的体积分数增至100%，保持9.5min。流动相恢复至80%甲醇的初始流动相后，柱平衡5min，再准备下一次进样；进样体积5μL。

质谱条件采用电喷雾离子化模式（ESI），根据化合物的性质选择正离子检测；采用多反应监测模式（MRM模式），监测母离子m/z为340.1，定量子离子m/z为125.0，定性子离子m/z为188.0。对质谱条件采用单因素优化实验，最优的检测条件为：毛细管电压4000V（+），干燥气为氮气，流速10L/min，干燥气温度为350℃，雾化器压力为50psi，鞘气流速为11L/min，鞘气温度为350℃。

3 结果与讨论

3.1 前处理条件优化

血液样品体系中含有大量的蛋白质、磷脂等杂质，不仅会因为基质效应影响检测的灵敏度，而且在液相色谱柱中分离时，蛋白质大分子也会堵塞柱系统，造成柱压快速上升，影响色谱柱的使用寿命。因此，有效去除血液样品中的蛋白质等大分子是十分必要的。以往的文献中，常规血液样本中蛋白质的去除多采用乙腈沉淀蛋白，再经微孔滤膜过滤的方法。在实验中，发现常用的0.22μm的微孔滤膜（Nylon膜和PES膜）对目标物JWH-203都存在严重的吸附效应，吸附损失在30%～70%，尤其是对低浓度的样品吸附损失更严重。若是只用乙腈沉淀蛋白，不经微孔滤膜过滤，多次进样后仍然会导致柱压升高。因此，本实验中选择了SPE的前处理方法，采用60-C18 HCE 100mg的SPE小柱，该柱填料的材料表面带有正电荷，对目标物JWH-203除了疏水性作用外，还有电荷作用，有利于屏蔽材料表面硅羟基对JWH-203的作用，改善峰形，并且采用0.2%甲酸的乙腈-水（80:20，V:V）洗脱液进行洗脱时，洗脱效率显著高于常规C18-SPE柱。本实验采用60-C18 HCE 100mg的SPE小柱，对JWH-203的上样、淋洗及洗脱条件进行了系统优化，具体条件见“2.3”样品处理部分，对100ng JWH-203标准品的回收率为95%～107%。

3.2 LC-MS检测条件的选择

质谱条件优化：从目标物JWH-203的分子结构可以看出，该分子容易产生[M+H]+，因此选择正离子检测模式，全扫描模式，得到JWH-203的分子离子峰（母离子）后，对分子离子进行碰撞诱导解离分析，根据得到的二级全扫描质谱的主要碎片离子，确定定量和定性分析的子离子。然后，采用单因素实验的方法，优化质谱的各个参数使检测的响应值最大（具体条件参见“2.4”仪器条件）。本实验采用MRM多反应监测模式，有利于降低背景干扰，提高灵敏度。

色谱分离优化：分别以甲醇、乙腈和水为流动相，考察了不同条件下JWH-203的分析结果，最终选择甲醇-水为流动相，采用梯度洗脱的方式（具体分离条件见“2.4”仪器条件），JWH-203出峰后，保持甲醇冲洗柱系统，以便将样品中的杂质全部洗脱出来。

3.3 线性范围与最低检出限

将分别添加4、10、40、100和200ng/mL“2.2”中配制的血清样品中JWH-203的系列标准溶液，按照“2.3”样品处理方法处理后，经LC-MS分析，以血清中JWH-203的浓度为横坐标，定量离子峰面积为纵坐标绘制曲线，拟合出线性回归方程，Y =7 90.11 X + 583.10，R2= 0.9990。因此，该方法定量检测血清中JWH-203浓度在4ng/mL～200ng/mL范围具有良好的线性关系。以3倍信噪比为标准，测得血清中JWH-203的最低检出限为0.2ng/mL。

3.4 回收率与精密度

通过测定线性范围内低、中、高3个浓度的质控样品的回收率和相对标准偏差来考察方法的准确性和精密度。按照“2.2”方法配制4、40、200ng/mL 3个浓度水平的质控样品，每个浓度平行配制6份，按照“2.3”方法处理后，经LC-MS分析，根据测定的定量离子峰面积和拟合的线性方程获得方法的准确度（相对回收率）。实验结果表明，3个浓度的相对回收率平均值（n=6）分别为102.12%、101.16%、97.53%。每个浓度同一天内连续提取测定3次，并连续测定3天，得到方法的日内精密度平均值为2.71%，日间精密度平均值为7.02%，详细结果参见下表，表明方法不存在系统性偏差。

3.5 基质效应与处理效率

液质分析中，由于分析物的共流出组分会影响电喷雾接口的离子化效率，从而产出基质效应。基质效应是通过比较3个不同条件下的信号峰面积获得的，Set1：JWH-203的甲醇溶液，Set2：血清样品基质经SPE提取后添加JWH-203，Set3：血清中添加JWH-203后再经SPE提取处理。基质效应（ME）= Set2 / Set1，提取回收率（RE）= Set3/ Set2，方法处理效率（PE）= Set3 / Set1。按照“2.2”方法配制4、40、200ng/mL 3个浓度水平的质控样品，每个浓度平行配制6份，按照“2.3”方法处理后，经LC-MS分析，通过测量各个浓度样品的定量离子峰面积，获得方法的基质效应、提取回收率和处理效率数值。从结果可以看出，所建立的SPE前处理方法的提取回收率大于82%，远远高于文献[16]报道的回收率54.7%。方法的处理效率和相对回收率接近100%，完全满足检测需求。

表 血清中JWH-203的基质效应、回收率、处理效率和精密度

4 结论

本文建立了固相萃取-高效液相色谱-三重四极杆质谱法检测血清中合成大麻素JWH-203的检测方法，并系统考察了方法的线性范围、精密度和基质效应等参数，国内生物检材中合成大麻素的检测，目前尚未见于文献报道，并且本文所建立检测方法的回收率远高于国外文献报道的液液萃取-液质联用检测方法的回收率。鉴于国内发现的新型毒品合成大麻素JWH-203主要是以固体粉末或植物基质“香料”的形式，尚未有吸毒人员的案例报道，因此，没有将该检材方法应用于实际案例中血清样品的检测，但该方法的建立可以给法庭科学中血液样品中合成大麻素JWH-203的检验鉴定提供借鉴和技术支持。

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O657.63

A

2095-7939（2017）05-0079-04

10.14060/j.issn.2095-7939.2017.05.015

2017-03-30

辽宁省教育厅科学研究一般项目（编号：L2014510）。

徐秀明（1980-），女，山东淄博人，辽宁警察学院刑事技术系讲师，博士，主要从事毒品毒物分析检验研究。

（责任编辑：孟凡骞）