PEI-Fe3O4纳米颗粒标记人羊膜上皮细胞

张殿宝，李 莹，苏 航，王 竟，施 萍，庞希宁

中国医科大学 1基础医学院干细胞与再生医学研究室 2第一临床学院肛肠外科 3第一临床学院全科医学教研室，沈阳 110122

·论著·

PEI-Fe3O4纳米颗粒标记人羊膜上皮细胞

张殿宝1，李 莹1，苏 航2，王 竟2，施 萍3，庞希宁1

中国医科大学1基础医学院干细胞与再生医学研究室2第一临床学院肛肠外科3第一临床学院全科医学教研室，沈阳 110122

目的探索使用PEI-Fe3O4纳米颗粒标记人羊膜上皮细胞(hAEC)。方法采用透射电子显微镜和动态光散射表征PEI-Fe3O4纳米颗粒。使用纳米颗粒标记原代培养的hAEC，普鲁士蓝染色评价其标记效率，台盼蓝染色法和CCK- 8法检测细胞存活率和细胞毒性。结果PEI-Fe3O4纳米颗粒呈紧凑的球形，平均粒径为13 nm，水动力学半径为17.56 nm，zeta电位为+34.5 mV。浓度大于20 μg/ml的纳米颗粒对hAEC的标记效率达到91%。50(t=16.37，P<0.0001；t=10.39，P<0.0001)、100 μg/ml(t=29.89，P<0.0001；t=16.86，P<0.0001)纳米颗粒浓度下的hAEC存活率和细胞活力均明显低于未标记时。结论PEI-Fe3O4纳米颗粒可用于标记hAEC，在其工作浓度下未表现出显著的细胞毒性。

PEI-Fe3O4纳米颗粒；人羊膜上皮细胞；标记

人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cell，hAEC)是人胎盘羊膜组织靠近胎儿侧的单层上皮细胞，来源于胚外外胚层。hAEC具有多向分化潜能，同时具有免疫原性低、来源丰富和没有伦理争议等优点，在干细胞与再生医学领域中拥有潜在的应用前景[1]。在羊膜上皮细胞的基础研究与临床试验中，需要对细胞在植入体内后的存活、迁移和分化等进行活体动态监测[2]，目前尚缺乏安全高效的技术方法[3]。本研究将PEI-Fe3O4纳米颗粒用于标记hAEC，检测了不同浓度的纳米颗粒对羊膜上皮细胞的标记效率，通过检测细胞存活率和细胞毒性评价其安全性，同时也对PEI-Fe3O4纳米颗粒进行了表征，以期为hAEC的体内示踪提供新的方法和思路。

材料和方法

hAEC的分离培养经产妇知情同意，无菌采集健康足月剖宫产胎膜。将羊膜与绒毛膜钝性分离，置于含庆大霉素和两性霉素B的生理盐水清洗，之后将羊膜剪成小块，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA于37 ℃处理1 h以消化上皮细胞。经200目细胞筛过滤后离心收集细胞，重悬后培养于添加10% FBS的DMEM高糖培养液。本研究经中国医科大学第一临床学院伦理委员会批准。

PEI-Fe3O4纳米颗粒的表征PEI-Fe3O4纳米颗粒由南京东纳生物科技有限公司合成，使用透射电子显微镜于120.0 kV观察纳米颗粒的形态并采集图像，分析纳米颗粒的粒度。透射电子显微镜样品制备方法依文献[4]方法进行。采用动态光散射测定纳米颗粒的流体动力学尺寸和zeta电位。

纳米颗粒标记hAEC将对数生长期的hAEC接种于6孔板中，每孔使用2 ml培养液，标记前培养12 h。向培养的hAEC中分别加入不同量的纳米颗粒，使纳米颗粒终浓度分别为0、10、20、50和100 μg/ml，混匀后培养过夜，更换新鲜的培养液。

普鲁士蓝染色检测标记效率采用普鲁士蓝染色观察hAEC对纳米颗粒的摄取。对6孔板中经纳米颗粒标记的细胞进行普鲁士蓝染色。普鲁士蓝染色前使用4%多聚甲醛在室温固定30 min，用PBS洗涤3次。然后将细胞于含2%亚铁氰化钾的6%盐酸溶液(Perl试剂)中孵育30 min，并再次洗涤。采用倒置相差显微镜观察并成像，Media Cybernetics公司的Image-Pro Plus v 6.0软件分析着蓝色的细胞数和细胞总数，计算纳米颗粒对hAEC的标记效率。

台盼蓝染色检测hAEC存活率采用碧云天台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒检测hAEC存活率。使用胰酶消化细胞，离心收集后重悬，20 μl台盼蓝染色液与等体积的细胞悬液混合，室温染色3 min。吸取20 μl经过染色的细胞，采用Counterstar自动细胞计数仪检测细胞存活率。

CCK-8检测细胞活力采用CCK- 8试剂盒检测纳米颗粒对hAEC的毒性作用。将羊膜上皮细胞培养于96孔板中，检测时每孔加入10 μl的CCK- 8试剂，每组设5个复孔，之后在37 ℃培养箱中孵育2 h。使用iMARK酶标仪在450 nm处测定每个样品的吸光度。

统计学处理采用GraphPad Prism 6.0统计软件，实验数据以均数±标准差表示，多组间差异比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD多重比较，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

PEI-Fe3O4纳米颗粒的表征在透射电子显微镜下可见PEI-Fe3O4纳米颗粒呈紧凑的球形，平均粒径为13 nm(图1)。动态光散射检测纳米颗粒的水动力学半径为17.56 nm，zeta电位为+34.5 mV(图2)。由于PEI的电荷特征，PEI-Fe3O4纳米颗粒的zeta电位呈较强的正电性，具有良好的稳定性。此外，本研究中还观察了PEI-Fe3O4纳米颗粒的胶体稳定性，结果发现PEI-Fe3O4纳米颗粒在水中的稳定性好，长时间放置依然表现出良好的分散性。

图1 透射电子显微镜观察PEI-Fe3O4纳米颗粒

Fig1 Morphology of PEI-Fe3O4nanoparticles under transmission electron microscope

图2 动态光散射表征纳米颗粒zeta电位

Fig2 The zeta potential of the nanoparticles by dynamic light scattering

纳米颗粒对羊膜上皮细胞的标记效率采用普鲁士蓝染色法观察PEI-Fe3O4纳米颗粒标记hAEC的效率，结果显示，在纳米颗粒浓度达20 μg/ml时，镜下可见hAEC内着蓝色的纳米颗粒(图3)；10、20、50、100 μg/ml纳米颗粒浓度下对hAEC的标记率分别为(31.67±12.06)%(t=6.72，P<0.0001)、(91.00±3.61)%(t=19.30，P<0.0001)、(95.00±2.65)%(t=20.15，P<0.0001)、(97.33±1.16)%(t=20.65，P<0.0001)，均明显高于未标记时的0，具有浓度依赖性。

纳米颗粒标记后的hAEC存活率台盼蓝染色细胞存活率检测结果显示，10、20、50、100 μg/ml纳米颗粒浓度下的hAEC存活率分别为(95.67±0.58)%、(94.33±0.58)%、(66.00±4.00)%、(40.67±3.06)%，其中，50(t=16.37，P<0.0001)、100 μg/ml(t=29.89，P<0.0001)纳米颗粒浓度下的hAEC存活率均明显低于未标记时的(96.67±0.58)%。

图3 普鲁士蓝染色观察细胞摄取的纳米颗粒

Fig3 Prussan blue staining for cellular uptake of the nanoparticles

hAEC活力CCK- 8法检测结果显示，10、20、50、100 μg/ml纳米颗粒浓度下的细胞活力分别为1.70±0.07、1.59±0.08、1.20±0.08、0.89±0.09，其中，50(t=10.39，P<0.0001)、100 μg/ml(t=16.86，P<0.0001)纳米颗粒浓度下的细胞活力明显低于未标记时的1.69±0.06。

讨 论

hAEC来源于分娩后废弃的羊膜组织，其含量丰富，可在体外进行分离和培养[5]。hAEC具有较强的分化能力，可在体外诱导分化为成软骨细胞、神经元细胞[6]、心肌细胞[7]和肝细胞等[8]，有望成为细胞替代治疗和再生医学的优良的细胞来源。此外，hAEC免疫原性低，仅表达少量的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)-Ⅰ类抗原，不表达MHC-Ⅱ类抗原，异体移植无免疫排斥反应或反应较弱，使用时不须经过严格配对，适宜于不同个体之间的移植，是细胞治疗的理想种子细胞[9]。研究表明，hAEC在脊髓损伤、中风、阿尔茨海默病[10]、心脏病[7]、糖尿病[8]、骨关节炎和类风湿性关节炎[11]等疾病的治疗中具有潜在的应用价值。

观察细胞移植后的生物学行为是研究细胞治疗的作用机制和评价治疗效果的重要手段，目前多使用细胞体外示踪剂标记细胞后移植的方法，标记方法主要包括使细胞表达特异性标志物(如绿色荧光蛋白)、染料标记(如5-溴脱氧尿嘧啶核苷和量子点)和纳米颗粒标记(如超顺磁性氧化铁颗粒)等，标记之后采用磁共振成像或活体光学成像等分子影像学技术进行观察[12]。其中，磁共振成像的可观察周期较长，时间和空间分辨率高，对比度好，可观察细胞的动态迁徙过程[13]。以铁的氧化物为核心的超顺磁性纳米颗粒可以作为阴性磁共振成像造影剂，通过内吞等途径进入细胞实现细胞标记和核酸递送等功能[4]。

本研究中使用PEI包被的Fe3O4纳米颗粒的平均直径仅为13 nm，其表面带正电荷，有利于接触细胞膜进入内吞途径。使用浓度大于20 μg/ml的PEI-Fe3O4纳米颗粒标记hAEC能够达到较高的标记效率，并且20 μg/ml的纳米颗粒作用于hAEC时，未检测到显著的细胞毒性作用。本研究中使用台盼蓝染色检测细胞存活率、CCK- 8法检测细胞活力，通过两种方法检测纳米颗粒对细胞的毒作用。其中，台盼蓝能够进入死细胞使死细胞着色，但无法进入活细胞内，从而判断细胞状态。由于本研究中使用的PEI-Fe3O4纳米颗粒主要与细胞膜作用，通过内吞途径进入细胞[4]。当纳米颗粒浓度过大时，细胞膜遭到破坏，导致细胞死亡。因此，台盼蓝染色能够较好地反映细胞的存亡和细胞膜完整性。CCK- 8法是通过检测线粒体酶活性，评价细胞活力和细胞毒性作用，反映纳米颗粒对细胞活力的影响。通过两种不同的方法从不同角度研究纳米颗粒对羊膜上皮细胞的毒性作用。

综上，本研究结果显示，PEI-Fe3O4纳米颗粒能够在体外高效率地标记hAEC，同时具有良好的生物相容性，为使用纳米颗粒对hAEC进行标记和体内示踪奠定基础。

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PEI-Fe3O4NanoparticlesforHumanAmnioticEpithelialCellsLabeling

ZHANG Dianbao1，LI Ying1，SU Hang2，WANG Jing2，SHI Ping3，PANG Xining1

1Department of Stem Cells and Regenerative Medicine，College of Basic Medical Sciences，2Department of Anus & Intestine Surgery，the First Clinical College，3Department of General Practice， the First Clinical College，China Medical University，Shenyang 110122，China

SHI Ping Tel：024- 83282946，E-mail：13998309428@163.com；

ObjectiveTo label human amniotic epithelial cells(hAECs) by using PEI-Fe3O4nanoparticles.MethodsThe PEI-Fe3O4nanoparticles were characterized by using transmission electron microscopy and dynamic light scattering. The primary cultured hAECs were labeled with the nanoparticles，and the labeling efficiency was evaluated by Prussian blue staining. The cell survival rate and viability were tested by using placenta blue staining and CCK- 8 assay，respectively.ResultsThe PEI-Fe3O4nanoparticles were compact spheres with an average particle size of 13 nm，a hydrodynamic radius of 17.56 nm，and a zeta potential of+34.5 mV. The labeling efficiency of the nanoparticles on hAECs reached 91% when the concentrations were greater than 20 μg/ml. When the concentrations of nanoparticles were at 50 μg/ml(t=16.37，P<0.0001；t=10.39，P<0.0001) and 100 μg/ml(t=29.89，P<0.0001；t=16.86，P<0.0001)，the cell survival rates and cell viabilities were significantly reduced versus controls.ConclusionThe PEI-Fe3O4nanoparticles can be used for labeling hAECs without obvious cytotoxicity at its working concentration.

PEI-Fe3O4nanoparticles；human amniotic epithelial cells；labeling

国家重点基础研究发展计划(2012CB518103)、辽宁省医疗器械研发项目(2014305012)、沈阳市干细胞与再生医学重点实验室项目(F15- 157- 1- 00)、沈阳市科学技术计划项目(F14- 201- 4- 00)和中国医科大学科研基金(XZR20160022)Supported by the National Basic Research Program of China(2012CB518103)，the Medical Equipment Research and Development Project of Liaoning Province(2014305012)，Shenyang Key Laboratory Project(F15- 157- 1- 00)，the Science and Technology Planning Project of Shenyang(F14- 201- 4- 00)，and the Foundation of China Medical University(XZR20160022)

施 萍 电话：024- 83282946，电子邮件：13998309428@163.com；

庞希宁 电话：024- 31939615，电子邮件：pangxining@126.com

Q2-33

A

1000- 503X(2017)05- 0611- 04

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.05.003

PANG Xining Tel：024- 31939615，E-mail：pangxining@126.com

ActaAcadMedSin，2017,39(5)：611-614

2016- 07- 22)