p62在NSCLC组织中的表达及其与化疗效果的关系

缪小辉 许 姣 周 尧 周燕娟 庄志方

p62在NSCLC组织中的表达及其与化疗效果的关系

缪小辉 许 姣 周 尧 周燕娟 庄志方

目的探讨自噬相关蛋白p62在非小细胞肺癌患者中的表达及其与化疗效果的关系。方法选择60例确诊为NSCLC并接受联合化疗患者，并选择同期诊断为肺部良性疾病60例患者的外周血标本作为对照，采用免疫组化检测各组织标本中p62表达，ELISA检测患者外周血p62水平。结果①与对照组相比，NSCLC组p62高表达，化疗前后NSCLC患者外周血p62表达量及阳性表达率存在显著差异(P<0.05)；②化疗有效者与无效者p62阳性率存在显著差异(P<0.05)。结论自噬相关蛋白p62在非小细胞肺癌呈高表达，且p62表达与NSCLC化疗效果有关，可作为NSCLC肿瘤指标及预测因子之一。

非小细胞肺癌;p62

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1588～1590)

肺癌是全世界范围内最常见的恶性肿瘤，也是全球癌症死亡的首要原因。在美国，肺癌在男性和女性的恶性肿瘤中的病死率均居第一位。在发展中国家，特别是中国，肺癌的发生率一直呈上升趋势，到2025年我国每年肺癌患者将超过100万，成为世界第一肺癌大国。非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)占全部肺癌约85%。NSCLC的治疗在过去的几十年并未取得突破性的进展，即使Ⅰ期的NSCLC患者，其5年生存率也只有50%，Ⅱ期患者5年生存率只有30%，5年生存率仍然不到15%，肿瘤侵袭以及转移是肺癌患者死亡的主要原因。因此，大量的实验研究都在寻求敏感性和特异性都较高的分子标记物，可以早期诊断，评估疗效和判断预后。

1 材料与方法

1.1 资料

以2014年01月至2015年09月期间在本院就诊经术后病理组织学检查确诊为NSCLC的患者60例为研究对象(肺癌组)。其中男性35例，女性25例，年龄48～65岁。其中肺腺癌33例，肺鳞癌27例。选择肺部良性疾病组作为对照组。经病理证实为NSCLC，接受至少2个周期含铂类方案的联合化疗，于第1及3个周期化疗前行全身检查。化疗适应症如下：体力状况(PS)评分≤2分，重要脏器功能可耐受化疗。符合纳入标准的60名NSCLC患者，年龄48～79岁。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫组织化学检测方法 术后取部分新鲜组织标本10%福尔马林液固定，石蜡包埋切片；脱蜡处理；抗原修复；抗体封闭；PBS清洗3次，每次5 min；37 ℃孵育二抗(1∶1 000)；配置DAB工作液，避光反应30 min～1 h；脱水透明，中性树脂封片检测。

1.2.2 ELISA检测方法 在未进行化疗、第3个周期化疗前，收集NSCLC患者外周血标本，选择同期诊断为肺部良性疾病患者40例作为对照(肺部良性疾病组)，治疗前收集血标本，离心(12 000 r/min,20 min)后取上清液冻存于-20 ℃。ELISA检测NSCLC、肺部良性疾病组患者外周血蛋白p62：室温复温平衡30 min；p62抗原以0.5 μg/ml的稀释浓度包被96孔板；一抗为1∶50稀释的待测血清，100 μg/孔，PBS作为空白对照。加标准品和待测样本(空白对照孔不加)，37 ℃恒温箱孵育30 min后PBS液洗板4次。加入酶标工作液(空白对照孔不加)37 ℃恒温箱孵育30 min，PBS液洗板4次，依次加入显色剂，避光15 min，最后每孔中加终止液。

1.3 疗效评价标准

按照RECIST 1.1实体瘤疗效评价标准，化疗疗效评估分为：完全缓解(complete response,CR)、部分缓解(partial response,PR)、病灶稳定(stable disease,SD)和病灶进展(progressive disease,PD)。CR和PR定义为有效，SD和PD定义为无效。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 p62在NSCLC组织中的表达

肺鳞癌、腺癌组织中癌细胞胞质、胞核高表达p62(棕褐色颗粒为阳性细胞)，而肺部良性病变组几乎不表达p62。

化疗前后NSCLC患者外周血p62相对表达量的差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。NSCLC患者化疗前p62阳性表达率为83%(50/60)，化疗后p62阳性表达率为58%(35/60)，治疗前后p62阳性表达率存在显著差异(P<0.05)，见表2。

2.2 NSCLC外周血p62表达与化疗效果的关系(表3)

60例NSCLC患者治疗有效(CR+PR)35例，治疗无效(SD+PD)25例。化疗有效者与无效者p62阳性表达率存在显著差异，提示外周血中p62阳性表达与患者化疗效果显著相关(P<0.05)。

表1 NSCLC患者治疗前后外周血中p62相对表达量

表2 NSCLC患者治疗前后外周血中p62阳性表达情况(例，%)

表3 p62表达与化疗效果的关系/例

3 讨论

自噬(autophagy)是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新[1-2]。但很多研究发现肿瘤细胞可利用增强的自噬过程逃离“低氧、化疗”等应激环境，成为进展性肿瘤，但当代谢压力增加，尤其在细胞凋亡障碍的时候，过度激活的自噬还可以促使细胞死亡[3-4]。p62蛋白是c-myc原癌基因的表达产物,同时也是一种转录因子,在胚胎及成人部分增殖能力很强的组织(如肠道黏膜及皮肤)中呈高表达。通用转录因子2H肽1抗体(p62) 功能类似于支架蛋白，与泛素化蛋白结合,并将其运送至自噬小体内降解，在自噬过程中起着转运和降解蛋白的功能，因此,p62是反映自噬活性的标记蛋白[5]。近来很多研究发现自噬特异性底物p62的积累可以促进肿瘤的发生。P62在子宫颈鳞状细胞、结肠癌、乳腺癌等癌组织细胞质中的表达明显高于正常组织[6-8]。胆囊癌组织中p62蛋白持续表达抑制自噬相关基因如Beclin1等的表达，从而抑制肿瘤细胞的自噬活动，同时调控NF-KB因子，促使肿瘤细胞生长及转移[9-10]。闫兵等发现在肾透明细胞癌等肿瘤组织中高表达同时伴随自噬相关蛋白的下调[11]。本实验通过免疫组织化学技术证明了非小细胞肺癌肿瘤组织内自噬相关蛋白p62高表达，而癌旁正常肺组织中弱表达，提示自噬在非小细胞肺癌中表达水平下调。但本实验尚需进一步探索自噬其他相关蛋白如Beclin-1、LC3、ATG7等在非小细胞肺癌的表达情况。顾昕等研究结果证明人肺腺癌耐多西他赛细胞SPC-A1/DTX细胞高表达自噬相关蛋白LC3和Beclin-1，下调p62蛋白，同时放射治疗诱导的自噬，为人肺腺癌细胞耐受放射治疗过程提供了自我保护机制[12]。赵大海等通过体外实验发现培美曲塞诱导A549细胞自噬体表达增加，并诱导自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的表达，p62的表达降低。上述实验，提示在肿瘤放化疗可诱导自噬的增强。本实验首次通过临床体内实验证明化疗可降低p62在非小细胞肺癌外周血的表达，同时证明p62的表达水平与化疗效果相关。与顾昕、赵大海等实验结果一致，本实验提示肿瘤细胞对以铂类为基础的化疗的敏感性与自噬相关蛋白p62有关。推测，p62可作为NSCLC肿瘤指标及预测因子之一，但自噬相关蛋白p62如何参与非小细胞肺癌发生发展的尚需进一步研究。

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TheExpressionofp62inNSCLCandtheRelationshipwithChemotherapy

MIAOXiaohui,XUJiao,ZHOUYao,etal.

ChangzhouWujinPeople’sHospital,Changzhou,213000

ObjectiveTo analyze autophagy-associated protein p62 in peripheral blood of patients with NSCLC and explore the relationship between the expression of p62 and the chemotherapy effect.MethodsIHC were adopted to detected expression levels of p62 in NSCLC lung tissues.Enzyme-linked immunosorbent assay was applied to investigate the expression of p62 in peripheral blood of patients with NSCLC and benign lung diseases in our hospital at the same time.Results①The expression levels of p62 in NSCLC tumor tissues were significantly expressed.The concentrations of p62 had a significant differences between pre-chemotherapy and post-chemotherapy(P<0.05).At the same time,positive rates of post-chemotherapy p62 decline significantly；②The positive rates of p62 in peripheral blood from patients were significant different between effective and ineffective group(P<0.05).ConclusionAutophagy-associated protein p62 expressed highly in tumor cells of NSCLC.The p62 in NSCLC peripheral blood has some relationship with chemotherapy and can be used as a marker and predictor for NSCLC.

NSCLC;p62

江苏大学医学临床科技发展基金项目(编号：JLY20140041)

213000 江苏省常州市武进人民医院

庄志方

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.10.007

R734.2

A

1001-5930(2017)10-1588-03

2016-09-23

2017-07-24)

(编辑吴小红)