miR-586在骨肉瘤患者体内的表达及意义的相关研究

陈是煌，尹 毅，郭志宏，陈 伟

（昆山市第一人民医院脊柱外科，苏州 310000）

miR-586在骨肉瘤患者体内的表达及意义的相关研究

陈是煌，尹 毅，郭志宏，陈 伟

（昆山市第一人民医院脊柱外科，苏州 310000）

目的：探究miR-586在骨肉瘤患者体内的表达及意义。方法：选取我院2014年9月～2016年9月收治的骨肉瘤患者151例，将其作为观察组，选择同期于我院进行体检的健康的志愿者52例，将其作为对照组，对患者瘤体周围正常骨组织及骨肉瘤瘤体组织中miR-586的表达、两组血清miR-586的表达、患者血清中miR-586表达与骨肉瘤患者瘤体组织的相关性、miR-586对骨肉瘤的诊断价值进行分析。结果：瘤体周围正常骨组织、骨肉瘤瘤体组织的miR-586相对表达水平分别为（0.94±0.27）、（5.34±0.29），患者瘤体周围正常骨组织较骨肉瘤瘤体组织中miR-586相对表达水平高，差异明显具有统计学意义；观察组、对照组血清miR-586的相对表达水平分别为（1.48±0.47）、（0.85±0.22），观察组较对照组高，差异明显，具有统计学意义；经皮尔森相关系数分析发现，患者血清中miR-586与骨肉瘤患者瘤体组织呈正相关的关系；经对观察组、对照组患者外周血miR-586水平ROC曲线分析，曲线下面积为0.882（0.774、0.991为95%可信区间；P=0.023），当0.9551为最佳筛查阳性届值（cut-off）时，特异度及敏感度均为85%。结论：miR-586对骨肉瘤患者具有较好的诊断价值，其表达水平可作为骨肉瘤患者诊断的生物学指标。

miR-586；骨肉瘤；诊断价值

恶性骨肿瘤具有3种类型，分别为继发性骨肿瘤、原发性骨肿瘤及转移性骨肿瘤三种，近年来，临床多采用新辅助治疗的方式对患者进行治疗，患者的生存期得到了明显改善［1］。骨肉瘤是一种原发恶性骨肿瘤，在骨恶性肿瘤中约占三分之一，常见于儿童和青少年，多发于四肢长骨部位，膝关节周围为最常发病部位，其发病率约为百万分之四［2-4］。骨肉瘤恶性程度高，其在局部进行侵袭性生长，早期多发生转移故临床对骨肉瘤患者的早期诊断尤为重要［5-6］。有研究指出，microRNAs（即miRNAs）是骨肉瘤发生、发展的重要指标［7-8］。miRNAs具有检测方法价格低、取材便捷的优点，被认为是一种具有早期检测、预后功能的生物标志物［9］。临床关于miR-586在骨肉瘤中的作用的相关研究甚少，故对miR-586在骨肉瘤患者体内的表达及意义进行了探究。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院2014年9月～2016年9月收治的151例骨肉瘤患者，将其作为观察组，其中男75例，女76例，年龄21～42岁，平均年龄（25.34±7.24）岁。纳入标准：经影像学检查、病史、活组织检查确诊为骨肉瘤。排除标准：排除于手术前接受过放疗或化疗的患者。同期选择于我院进行体检的健康的志愿者52例，将其作为对照组，其中男26例，女26例，年龄22～41岁，平均年龄（26.32±7.19）岁。所有患者在年龄、性别等方面没有差异，没有统计学意义（P＞0.05）。

1.2 样本处理及RNA提取 收集观察组术前新辅助化疗前及对照组晨起空腹外周静脉血2mL，肝素抗凝，30分钟的时间内，将其进行分装200µL全血于冻存管内，冻存管内装有研磨珠及Trizol，将其进行足够的震荡，然后将其置于-80℃的冰箱；对患者后蜀瘤体周围正常骨组织和骨肉瘤瘤体组织进行收集，然后将其放入液氮内进行保存。对患者总RNA进行抽取，抽取依据RNA提取试剂盒说明书（Invitrogen公司）进行，对其纯度、浓度进行测定，测定仪器为紫外线分光光度计，在电泳条件下对其完整性进行检测［10］。

1.3 反转录-荧光定量PCR检测 将RNA逆转录为cDNA，后进行检测，反转录试剂盒（Qiagen公司），20µL反应体系，其中 1µL反转录酶、1µL总的RNA，14RµL Nase Free 水、（5×）4µL反转录缓冲液。37℃为反应条件，5min95℃。进行实时荧光定量PCR检测，检测采用miScript SYBR Green PCR kit（Qiagen公司），反应体系依据说明书进行，预变性5min95℃为反应条件［11］；延伸及变性以10s95℃、20s60℃、20s72℃ 40个循环进行。20s78℃为荧光收集。内参为管家基因U6，miR-586的相对表达量依据相对定量法进行计算。5'-CGCGGATCCGTAAGAAGAAATCTGAATGCTTTTGT-3'为miR-586的引物。

1.4 观察指标 对患者瘤体周围正常骨组织及骨肉瘤瘤体组织中miR-586的表达、两组血清miR-586的表达、患者血清中miR-586与骨肉瘤患者瘤体组织的相关性、miR-586对骨肉瘤的诊断价值进行分析。

1.5 统计学方法 数据处理采用SPSS20.0统计软件。（± s）表示计量资料，用t对其进行检验 ；（%）表示计数资料，用χ2进行检验。miR-586的诊断效果依据ROC曲线进行评估，骨肉瘤患者瘤组织中miR-586表达水平与血清miR-586水平的相关性依据皮尔森相关系数进行评估。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者瘤体周围正常骨组织及骨肉瘤瘤体组织中miR-586的表达 患者瘤体周围正常骨组织较骨肉瘤瘤体组织中miR-586相对表达水平高，差异明显具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 患者瘤体周围正常骨组织及骨肉瘤瘤体组织中miR-586的表达

2.2 两组血清miR-586的表达 观察组较对照组患者的血清miR-586的相对表达水平高，差异明显，具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组患者血清miR-586的表达

2.3 患者血清中miR-586与骨肉瘤患者瘤体组织的相关性 经皮尔森相关系数分析发现，患者血清中miR-586与骨肉瘤患者瘤体组织呈正相关的关系（r=0.907，P=0.001）。

2.4 miR-586对骨肉瘤的诊断价值 经对观察组、对照组外周血miR-586水平ROC曲线分析，曲线下面积为0.882（0.774、0.991为95%可信区间；P=0.023），当0.9551为最佳筛查阳性届值（cut-off）时，特异度及敏感度均为85%。

3 讨论

骨肉瘤具有预后较差、恶性度高、多发于青少年等特点，早期易发生转移，有研究表示，骨肉瘤患者在确诊时多数患者已发生远端微转灶，骨肉瘤的转移给临床治疗及患者健康恢复带来了难题［12-14］。近年来，随着经济的快速发展，医疗科学水平的不断提高，骨肉瘤患者的生存率得到了一定改善，但其早期转移仍是临床面临的一个难题。有学者提出，肿瘤的转移率是骨肉瘤患者生存率的主要影响因素，患者一旦有转移的发生，生存率会受其影响而降低［15-16］。

有研究表明，miRNAs是一种生物标志物，可用于早期检测及预后，具有检测方法价格低、取材便捷的优点，在临床治疗中发挥了一定作用。但目前，临床对miR-586多集中在血压系统疾病及消化道肿瘤等方面，如罗耀玲等指出，miR-586会对Bc1-2通路产生影响，从而可发挥对HepG2细胞的增殖、凋亡的调节作用。但临床关于miR-586与骨肉瘤关系的相关研究甚少，目前仅有TENG等学者进行了体外细胞实验，经实验发现，患者骨肉瘤细胞的迁移、侵袭、分化、凋亡与miR-586存在一定联系，miR-586的下调对细胞的迁移、侵袭、分化具有抑制作用，对肿瘤细胞的凋亡具有促进作用［17］。且目前，临床尚无对miR-586的表达情况的相关研究，为减少骨肉瘤患者的痛苦，减少早期转移的发生，本研究对miR-586在骨肉瘤患者体内的表达及意义进行了探究。

研究结果显示，患者瘤体周围正常骨组织较骨肉瘤瘤体组织中miR-586相对表达水平高，这与相关研究结果一致。观察组较对照组患者的血清miR-586的相对表达水平高，骨肉瘤患者表达水平较正常健康患者高，说明血清miR-586的表达水平的提高具有一定程度的提示作用。经皮尔森相关系数分析发现，患者血清中miR-586与骨肉瘤患者瘤体组织呈正相关的关系，这说明血清miR-586对瘤体组织中miR-596的表达水平具有很好的反映作用，经分析，笔者认为可能是miR-596可参与到肿瘤发生的通路中去，参与方式为肿瘤增殖的信号分子。经对观察组、对照组患者外周血miR-586水平ROC曲线分析，曲线下面积为0.882（0.774、0.991为95%可信区间），当0.9551为最佳筛查阳性届值（cut-off）时，特异度及敏感度较高，说明miR-586对骨肉瘤患者具有较好的早期诊断价值。

综上所述，骨肉瘤患者的瘤体组织、血清中的miR-586表达水平明显提高，miR-586对骨肉瘤患者具有较好的诊断价值，其表达水平可作为骨肉瘤患者诊断的生物学指标。

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miR-586 studies on expression and meaning in patients with osteosarcoma

Chen Shi-huang, Yin Yi, Guo Zhi-hong, Chen Wei
(Department of Spine Surgery, the First People’s Hospital of Jiangsu, Suzhou 310000, China)

ObjectiveTo investigate the expression and significance of miR-586 in osteosarcoma patients.Methods151 patients with osteosarcoma in our hospital from September 2014 to September2016 were selected as the observation group. In the same period, 52 healthy volunteers were selected as our control group. Tumor surrounding normal bone tissue and osteosarcoma tissues and the expression of miR-586, two groups of patients with serum miR-586 expression in serum of patients with miR-586 and patients with osteosarcoma tumor correlation, the diagnostic value of miR-586 on osteosarcoma were analyzed.ResultsThe relative expression levels of miR-586 in the normal bone tissue and osteosarcoma tissue around the tumor were(0.94+0.27), (5.34+0.29). The relative expression of miR-586 in tumor tissues was higher than that in osteosarcoma tissues, and the difference was statistically significant. The relative expression levels of serum miR-586 in the observation group and the control group were (1.48+0.47), (0.85+0.22). The observation group was higher than the control group, and the difference was statistically significant. There was a positive correlation between miR-586 in serum and tumor tissue in osteosarcoma patients by Pearson correlation coefficient analysis. The miR-586 level and ROC curve of peripheral blood in the observation group and the control group were analyzed, the area under the curve was 0.882(0.774, 0.991 is 95% confidence interval; P=0.023),and when 0.9551 was the best screening positive term value (cut-off), the specificity and sensitivity were 85%.ConclusionMiR-586 has better diagnostic value for osteosarcoma, and its expression level can be used as a biological marker for the diagnosis of osteosarcoma.

MiR-586; osteosarcoma; diagnostic value

R738.1

A

1673-016X（2017）06-0061-03

2017-10-12

陈是煌，E-mail：865265818@qq．com