甘草甜素对癫痫持续状态大鼠神经保护作用及机制研究

王 林， 李亚军， 张 蓓， 常明则， 石少亭， 张世俊， 折 潇， 杨春梅

甘草甜素对癫痫持续状态大鼠神经保护作用及机制研究

王 林1,2， 李亚军2， 张 蓓2， 常明则3， 石少亭2， 张世俊2， 折 潇2， 杨春梅1

目的研究甘草甜素(glycyrrhizin,GL)对癫痫持续状态大鼠(status epilepticus,SE)神经损伤保护作用及相关分子机制。方法取清洁健康成年雄性SD大鼠60只，采用腹腔注射氯化锂-匹罗卡品的方法建立大鼠癫痫持续状态(SE)模型，随机分为甘草甜素组(SE+GL)和生理盐水组(SE+S)，分别经尾静脉给予甘草甜素及生理盐水进行干预，取正常大鼠作为对照组(control group,C)；根据给予GL剂量不同将其分为高剂量组(HGL,20 mg/kg)、中剂量组(MGL,10 mg/kg)及低剂量组(LGL,5 mg/kg)；通过尼氏染色(NS)观察各组大鼠SE后24 h时大脑皮质神经元损伤情况，分别采用酶联免疫吸附法(ELISA)和蛋白印迹实验(Western blot)检测各组大鼠SE后24 h时血清及大脑皮质中高迁移率族蛋白(HMGB1)的表达水平。结果SE+S组大鼠大脑皮质神经元在癫痫持续状态后24 h明显受损，SE+GL各组皮质受损神经元数量较SE+S组减少，且在不同给药剂量组间存在显著差异(P<0.05)；SE+GL各组在SE后24 h时大脑皮质及血清中HMGB1的表达水平较SE+S组显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论经尾静脉给予GL能有效地减少SE后大鼠大脑皮质神经元损伤，且其神经保护作用呈剂量依赖性，其机制可能与其抑制血清及大脑皮质炎性因子HMGB1的表达有关。

癫痫持续状态； 甘草甜素； 大脑皮质神经元； HMGB1

癫痫是大脑神经元突发异常放电引起的一种神经功能障碍综合征，目前全世界约有5000万人罹患癫痫，目前的治疗措施较多，约有60%～70%的癫痫患者病情得到控制，但仍有部分患者治疗效果有限或并发症较多，因而进一步探索抗癫痫损伤神经保护途径及机制显得愈发重要[1]。高迁移率组蛋白(high mobility group box-1 protein,HMGB1)的抑制剂甘草甜素(glycyrrhizin,GL)对中枢神经系统疾病如大鼠出血性和缺血性卒中的脑保护作用及机制已得到越来越多的关注[2～6]，但GL在大鼠SE后的神经保护作用及相关分子机制尚未见报道。本研究通过建立氯化锂-匹罗卡品诱导大鼠癫痫发作并依据Racine分级标准筛选SE模型[7]，经大鼠尾静脉给予GL或生理盐水进行干预，采用尼氏染色(nissl staining,NS)、酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、蛋白印迹实验(western blot,WB)观察各组大鼠SE后24 h大脑皮质神经元损伤情况以及不同药物剂量组大脑皮质与血清中HMGB1表达水平的改变，旨在探索GL在大鼠癫痫持续状态后的神经保护作用及相关分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料与设备 造模用氯化锂、匹罗卡品、甘草甜素(货号-1295888)均购于Sigma Aldrich公司(中国)，兔抗大鼠HMGB1多克隆抗体、小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体均购于BOSTER公司(中国武汉)，紫外分光光度仪为BIO-RAD公司(美国)，高速冷冻离心机为Fermentas公司(加拿大)，ELISA试剂盒(HMGB1)购于BIO-RAD公司(美国)，石蜡切片机为LEICA公司(德国)，光学显微镜为NIKON公司(日本)。

1.2 动物分组及癫痫持续状态模型建立 健康清洁级成年(6～8 w)雄性SD大鼠60只，购于西安交通大学实验动物中心，自由饮水，标准饲料喂养，适应新环境1 w后造模。SE模型：采用Costa-Ferro等沿用的方法建立SE模型[7,8]，将大鼠依次称重后依次经腹腔给予氯化锂(127 mg/kg)，在20 h后经腹腔注射阿托品(0.1 mg/kg)以降低匹罗卡品的外周胆碱能反应，在给予阿托品后半个小时，腹腔注射匹罗卡品(40 mg/kg)，观察大鼠癫痫发作的程度，根据经典的Racine分级标准[7]筛选入组大鼠，达到Ⅳ级或以上的SE大鼠纳入实验，在SE后30 min经腹腔给予地西泮(10 mg/kg)终止发作。随机分为甘草甜素组(SE+GL，n=36)、生理盐水组(SE+S，n=15)和正常对照组(control group C，n=9)，SE+GL组在大鼠SE终止后30 min经尾静脉单次剂量GL，根据不同给药剂量分为3个亚组(每亚组n=12)，高剂量组(high glycyrrhizin group,HGL,20 mg/kg)；中剂量组(middle glycyrrhizin group,MGL,10 mg/kg)；低剂量组(low glycyrrhizin group,LGL,5 mg/kg)，SE+S组大鼠经尾静脉给予相同剂量的生理盐水，C组为正常大鼠未作处理。

1.3 Nissl染色计数皮质神经元数量 为观察各组大鼠(n=4)大脑皮质神经元数量，每组大鼠在SE造模成功后24 h经腹腔注射10%水合氯醛深度麻醉后，4%多聚甲醛进行体内灌注固定后并取出大鼠完整大脑，将脑组织置入4%多聚甲醛中后固定36 h，之后经脱水、透明、浸蜡、包埋制作为石蜡组织块。在石蜡切片机上做冠状连续切片，切片厚度为1 μm。恒温箱烤干后进行尼氏染色，图像处理用Image proplus 6.0软件进行，计算出各组大鼠大脑皮质神经元数量。

1.4 ELISA测定各组大鼠血清中HMGB1的表达 采用ELISA法测定各组大鼠(n=4)血清中HMGB1表达水平。各组大鼠在SE后24 h经腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，剪开大鼠胸腔，直视下经大鼠右心房取血2 ml，在4 ℃冰箱中静置30 min后，3000 r/min离心20 min，取上清液，根据ELISA试剂盒中操作步骤进行检测各组样本的OD值，通过依据标准品OD值及浓度所建立的线性回归方程计算出各组大鼠血清中HMGB1的浓度(μg/L)，最后进行统计学分析。

1.5 Western blot测定各组大鼠大脑皮质中HMGB1的表达 采用Western blot测定各组大鼠(n=4)大脑皮质中HMGB1表达水平。剪开取血标本后的大鼠顶骨，取出大鼠完整大脑及小脑组织，冰上切除小脑后快速分离双侧大脑皮质，将分离好的各组大鼠双侧大脑皮质在微量电子称上称重后进行总蛋白提取、蛋白浓度定量、SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、封闭和杂交、显影反应及Image-Pro Plus 软件进行条带光密度分析。

2 结 果

2.1 GL对SE后大鼠大脑皮质神经元的保护作用 正常对照组大脑皮质神经元排列规律，细胞形态规则，细胞膜完整，细胞核清晰；生理盐水组在SE后24 h大脑皮质神经元排列紊乱，细胞体积减小，形态不规则，细胞皱缩，细胞浆浓集，细胞核不清晰；而与生理盐水组相比，GL组大鼠大脑皮质神经元受损程度明显减轻，HGL组、MGL组及LGL组皮质正常神经元密度均高于生理盐水组，其中HGL组及MGL组皮质神经元密度较生理盐水组显著增高(P<0.005)，且高于LGL组(P<0.05)，但在HGL组和MGL组两组间比较无显著统计学差异(P>0.05)。尼氏染色结果显示经尾静脉给予GL能够减少大鼠SE后大脑皮质受损神经元数量，对SE后大鼠大脑皮质神经元损伤有保护作用(见图1)。

2.2 GL对SE后大鼠血清中HMGB1表达的影响 采用ELISA检测SE后24 h各组大鼠血清中HMGB1的表达水平，结果显示HGL组、MGL组及LGL组HMGB1的表达水平较SE+S组均显著降低(P<0.05)，且随着GL剂量的增加，血清中HMGB1的水平降低幅度越显著，表明GL能够有效地降低SE后的大鼠血清中升高的HMGB1水平，且呈剂量依赖性，其差异有统计学意义(P<0.01)(见图2)。

2.3 GL对SE后大鼠大脑皮质HMGB1表达的影响 采用Western-blot检测各组大鼠大脑皮质中HMGB1的表达水平，结果显示大脑皮质HMGB1的表达情况与血清中的相似，SE+S组的大鼠大脑皮质中HMGB1表达水平显著高于其他各组，与SE+S组相比，HGL组、MGL组及LGL组的大鼠大脑皮质中HMGB1表达水平显著降低(P<0.01)，HGL组及MGL组更为明显地减低了HMGB1表达水平，但此两组之间比较无显著统计学差异(P>0.05)(见图3)。

C：正常对照组；SE+S:生理盐水组；LGL：低剂量组；MGL：中剂量组；HGL：高剂量组。HGL组、MGL组和LGL组与SE+S组之间正常神经元密度比较。与SE+S组相比，HGL组和MGL组正常神经元密度增多尤为显著((###P<0.001,##P<0.01)，但HGL组和MGL组之间比较无统计学差异(ns)

图1 各组大鼠脑组织尼氏染色(×40)及神经元密度的比较

SE+S：生理盐水组；LGL：低剂量组；MGL：中剂量组；HGL：高剂量组。与SE+S组相比，HGL组、MGL组和LGL组中大鼠血清中HMGB1表达水平明显减低(#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001)

图2 ELISA检测大鼠血清中HMGB1的表达情况

C：正常对照组；SE+S：生理盐水组；LGL：低剂量组；MGL：中剂量组；HGL：高剂量组。与C组相比，SE+S组大鼠大脑皮质中HMGB1表达水平显著升高；与SE+S组相比，HGL组、MGL组和LGL组中大鼠大脑皮质中HMGB1表达水平明显减低(##P<0.01,###P<0.001)；与LGL组相比，HGL组和MGL组 HMGB1表达水平降低更为显著(**P<0.01)，但HGL组和MGL组之间HMGB1表达无统计学差异(ns)

图3 Western blot检测大鼠大脑皮质HMGB1的表达情况

3 讨 论

癫痫是中枢神经系统的常见病和多发病，癫痫持续状态(status epilepticus,SE)更是神经系统的急重症，具有极高致死率和致残率，严重影响着患者及家属的生活质量。目前对于癫痫发病相关病理生理机制的阐述和涉及的治疗手段众多，如药物、神经刺激及外科手术等。然而，传统的药物及手术等常受到毒副作用及并发症等影响，临床治疗效果并不理想[1]，因此，探索新的SE后神经保护药物及相关作用机制仍显得刻不容缓。

大量研究表明脑内炎症反应与癫痫紧密相关，特别是脑损伤或癫痫发作可以激活小胶质细胞和星形胶质细胞释放促炎介质，从而启动级联的脑组织的炎症过程[9]。动物实验表明许多炎症介质如细胞因子、补体、前列腺素等都参与了癫痫发生过程，抑制炎症因子及其受体的干预措施可以减少癫痫发生的频率、严重程度及病理损害[10～12]。临床研究资料发现在难治性颞叶癫痫及脑发育异常相关癫痫患者的脑组织中存在显著的炎症反应[13]。HMGB1作为炎症因子和炎性趋化因子，广泛表达于多种组织细胞，能参与调节基因转录、稳固胞核结构，且释放后具有炎症介质功能[14]。近年来有研究证实在脑卒中和蛛网膜下腔出血患者血浆或脑脊液中HMGB1升高的现象，认为HMGB1可以作为评价神经功能损伤和预后的一个可靠指标。GL作为HMGB1的特异性抑制剂，近几年国内外有关GL的神经保护作用的研究更是不断增多。新近研究证实GL可以通过抑制HMGB1减少大鼠脑出血引起的脑损伤以及缺血再灌注引起的肝损伤[15]，GL在大鼠大脑中动脉阻塞导致的脑缺血模型中也发挥了明显的神经保护作用，其作用机制为通过抑制HMGB1磷酸化，阻断HMGB1的分泌从而减轻炎症反应[2]。但HMGB1在SE中的作用机制以及GL在SE后的神经保护作用仍鲜有报道。

本次研究通过建立氯化锂-匹罗卡品诱导大鼠癫痫模型，结合前期实验我们发现SE后24 h时神经元损伤最重，因此选择在大鼠SE后24 h时通过尼氏染色法检测各组大鼠大脑皮质神经元的损伤程度，采用ELISA及Western blot检测大鼠血清中及大脑皮质HMGB1的表达变化。结果显示在SE后24 h大鼠大脑皮质神经元明显受损，大脑皮质正常神经元数目减少，血清及脑组织中HMGB1的表达明显上调，而经大鼠尾静脉给予GL干预后，大脑皮质神经元损伤明显减轻，大鼠血清及大脑皮质中HMGB1的表达下调，特别是血清中HMGB1的下降与GL给药量呈明显剂量依赖性，与LGL组相比，HGL组和MGL组在SE后24 h对大鼠血清及大脑皮质中HMGB1的抑制作用更为明显，对大脑皮质神经元损伤的保护作用也更为有效，但在抑制皮质HMGB1表达时,HGL组和MGL组两组间比较没有明显统计学差异。

本次研究结果表明尾静脉给予GL可以有效地减轻SE后大鼠大脑皮质神经元损伤，发挥神经保护作用。其作用机制可能与GL抑制脑组织及血清中HMGB1的表达有关，SE后HMGB1表达可能参与SE后神经细胞炎性坏死的病理过程，而GL通过抑制HMGB1的表达从而对大鼠SE后神经损伤起到保护作用。

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Protectiveeffectsandmechanismofglycyrrhizinonstatusepilepticusrats

WANGLin,LIYajun,ZHANGBei,etal.

(DepartmentofNeurology,TheFirstAffiliatedHospitalofXi’anMedicalUniversity,Xi’an710077,China)

ObjectiveTo study the protective effects and mechanism of glycyrrhizin on neuronal damage of Status Epilepticus (SE) rat hippocampus.Methods60 healthy adult male Sprague-Dawley rats were included in this study.SE rat model were induced by intraperitoneally injected with lithium and pilocarpine method.All rats were randomly divided into three groups:(SE+GL)-treated group,(SE+S) group and normal control group.According to different GL dosage,(SE+GL)-treated group were divided into three subgroup:high glycyrrhizin group (HGL,20 mg/kg),middle glycyrrhizin group (MGL,10 mg/kg),low glycyrrhizin group (LGL,5 mg/kg).The hippocampal neuronal damage was detected by nissl’s staining,levels of HMGB1 in serum and hippocampus were determined with enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and western blot.ResultsCompared with those in (SE+S) group,the cortical neurons damage significantly reduced and HMGB1 expressions were significantly decreased in (SE+GL)-treated group (P<0.05).ConclusionGL significantly decreased neuronal damage in the cortex of SE rat models,and it turned out dose-dependent.These results suggest that GL affords neuroprotective effects in lithium-pilocarpine induced SE rats,which may via inhibiting the expressions of HMGB1 in serum and cortical neurons.

Status epilepticus； Glycyrrhizin； Cortical neuron； HMGB1

R742.1

A

1003-2754(2017)10-0893-04

2017-06-12；

2017-09-28

陕西省科技统筹创新工程计划(No.S2015TLSF0010);陕西省教育厅基金(No.11JK0715);陕西省卫生厅科研基金(No.2012D43)

(1.宁夏医科大学临床医学院，宁夏 银川 750003；2.西安医学院第一附属医院神经内科，陕西 西安 710077；3.西安市中心医院神经内科，陕西 西安 710021)

李亚军，E-mail：liyajun9@hotmail.com