淫羊藿苷对阿尔茨海默病大鼠模型金属蛋白酶及紧密连接蛋白ZO-1表达的影响

陈仕检， 石胜良， 刘倩倩， 卢先富， 邓 珊， 阳 洪

淫羊藿苷对阿尔茨海默病大鼠模型金属蛋白酶及紧密连接蛋白ZO-1表达的影响

陈仕检1， 石胜良2， 刘倩倩1， 卢先富1， 邓 珊1， 阳 洪1

通迅作者：阳 洪，E-mail:yanghong19671130@163.com

目的探讨淫羊藿苷对阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)大鼠学习记忆、海马区基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、MMP-2及血脑屏障紧密连接蛋白ZO-1表达的影响。方法采用Aβ1-42海马注射建立AD大鼠模型，使用淫羊藿苷进行干预。以Morris水迷宫检测大鼠的空间学习记忆能力，采用Western-blot法分析紧密连接蛋白ZO-1的表达，用免疫组织化学法检测大鼠海马区MMP-9、MMP-2表达。结果与对照组相比，AD模型组大鼠学习记忆能力明显减退，ZO-1表达明显减少(P<0.05)，MMP-9、MMP-2蛋白明显增加；淫羊藿苷干预后，大鼠学习记忆能力均明显提高，海马区MMP-9/MMP-2表达减少(P<0.05)，ZO-1表达明显增加(P<0.05)，以淫羊藿苷高剂量干予后明显。结论淫羊藿苷能通过抑制MMP-9/MMP-2表达，减轻血脑屏障破坏，从而改善AD症状。

阿尔茨海默病； 淫羊藿苷； 紧密连接蛋白ZO-1； 金属蛋白酶-9; 金属蛋白酶-2

阿尔茨海默病(AD)以记忆、认知、情感、智力下降等为主要临床表现的慢性进行性神经系统退行变性疾病，尚缺乏有效的防治药物。研究显示90%以上的AD患者均存在血脑屏障破坏，研究认为Aβ损伤脑微血管内皮细胞而引起血脑屏障破坏可能是AD新的特征性病理改变[1]。研究发现淫羊藿苷在AD或多发性硬化等中枢神经系统疾病中存在抗炎、抗凋亡、免疫调节、改善神经功能等作用，能明显抑制IL-6、IL-1β和TNF-α的表达[2]。这些炎症因子均能不同程度地促进基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、MMP-2表达的作用[3]，金属蛋白酶与血脑屏障关系密切，这是否涉及淫羊藿苷对AD的保护机制呢? 目前国内外未见报道，亟需进一步研究。本研究使用淫羊藿苷对AD大鼠进行干预，通过Western-blot检测血脑屏障紧密连接蛋白ZO-1表达;免疫组化法检测大鼠海马区MMP-9和MMP-2的表达，研究淫羊藿苷对AD大鼠学习记忆及血脑屏障通透性的影响，探讨淫羊藿苷治疗阿尔茨海默病的新切入点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和分组 体重为280～300 g清洁级健康SD大鼠，从广西医科大学实验动物中心购买。实验期间动物自由饮用自来水并进食标准饲料。将SD大鼠随机分成AD模型组、淫羊藿苷低组、淫羊藿苷高组和正常对照组，每组12只。

1.1.2 主要试剂 淫羊藿苷，纯度>98%，由西安小草植物科技有限责任公司。Aβ1-42(美国sigma公司)，兔抗ZO-1单克隆一抗(abcam 公司)，兔抗MMP-9单克隆一抗、兔抗MMP-2单克隆一抗(武汉博士德生物技术有限公司)。荧光二抗(KPL，USA)GAPDH 单抗(碧云天)，蛋白Marker (Fermentas，立陶宛)。SP法免疫组化试剂盒、DAB显色盒(北京中杉金桥有限公司)。Odessay双色红外激光成像系统扫描仪。

1.2 方法

1.2.1 制备模型及药物干预 术前8 h禁食物，麻醉大鼠后，将大鼠平颅位固定于脑立体定向仪上。以包新民大鼠脑立体定位图谱为参考，确定两侧海马坐标:前囟后3 mm，正中矢状缝左右旁开2 mm，硬脑膜下3.5 mm。按上述定位点钻孔，每侧海马注射5 μl β淀粉样蛋白，0.5μl/min，并留针5 min，保证β淀粉样蛋白充分弥散，然后撤针，清创缝合，保温苏醒。并设0.01 mol PBS代替Aβ1-42注射作为对照组。之后开始进行药物干预。对照组和模型组按0.5 mg/100 g腹腔注射生理盐水；大鼠AD 模型制备后，次日起淫羊藿苷低组60 mg /kg，淫羊藿苷高组120 mg /kg，连续灌胃30 d。

1.2.2 大鼠行为学观察 药物干预30 d后，用Morris水迷宫系统对大鼠进行定向航行试验和空间搜索实验，历时6 d。前5 d每天训练4次：每只大鼠分别从4个不同象限入水训练一次，记录第1天、第3天、第5天大鼠寻找并爬上平台所需时间(逃避潜伏期)，取平均值作为每天的逃避潜伏期。第6天撤去平台进行空间搜索实验,将大鼠放入平台所在的对角线的象限内,记录2 min内大鼠穿过平台所在位置的次数，并以此作为各组大鼠记忆能力的改变。

1.2.3 血脑屏障紧密连接蛋白ZO-1检测 大鼠麻醉后取大鼠海马组织用液氮研磨法将组织研成粉，加入蛋白裂解液及蛋白酶抑制剂，在4 ℃下12000 r/min 离心20 min，提取上清液转移至离心管中，然后用BCA法检测蛋白浓度，以GAPDH为内参。因10%分离胶和5%浓缩胶，进行SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干法转膜30 min，用TBST配置的5%脱脂奶粉封闭1 h，1∶500一抗4 ℃敷育过夜，脱色摇床上用TBST洗膜5 min×3次，1∶10000红外荧光二抗室温敷育1 h后在Odessay双色红外激光成像系统扫描成像。

1.2.4 免疫组织化学染色 大鼠麻醉后经心脏依次灌注生理盐水冲洗和多聚甲醛固定后取海马，石蜡包埋切片，采用SP法行免疫组织化学染色，DAB显色。显微镜下观察海马区MMP-9/MMP-2的表达，阳性表达为胞浆或胞膜染成棕褐色或棕黄色，阴性对照用PBS代替一抗。每个标本取3张切片，随机选取5个不重叠的海马视野区高倍镜下(×400)观察，应用Image-Pro Plus 6.0图像处理软件测定每个视野的平均积分光密度值(IOD/area)。

2 结 果

2.1 各组定向航行试验及空间搜索实验 前5 d各组大鼠搜索平台的平均潜伏期逐渐缩短,AD模型组大鼠逃避潜伏期较正常对照组明显延长(P<0.05)，淫羊藿苷干预组大鼠潜伏期较AD模型组缩短，高剂量组更明显(P<0.05)。第6天，AD模型组大鼠穿越隐匿平台的次数比对照组明显减少(P<0.05)，而淫羊藿苷干预组学习记忆有所改善，淫羊藿高剂量穿越隐匿平台的次数比AD模型组明显增加(P<0.05)，与正常对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

2.2 各组血脑屏障紧密连接蛋白ZO-1检测 AD模型组海马的ZO-1 表达明显低于正常对照组(P<0.05)。淫羊藿苷低组海马ZO-1表达高于AD模型组(P<0.05)，淫羊藿苷高组ZO-1表达明显高于低剂量组(P<0.05)，而较正常对照组降低(P<0.05) (见图1)。

2.3 免疫组织化学染色MMP-9/MMP-2在海马中的表达 AD模型组海马区MMP-9/MMP-2蛋白的表达较其它组均明显增高(P<0.05),淫羊藿高苷MMP-9表达较淫羊藿苷低组明显降低(P<0.05),而比正常对照组明显升高(P<0.05)；淫羊藿高苷MMP-2表达较淫羊藿苷低组明显降低(P<0.05),而与正常对照组比较无统计意义(P>0.05)(见表2、图2)。

表1 各组大鼠各时间点逃避潜伏期及跨越平台次数的比较

与AD模型组比较*P<0.05；与淫羊藿苷低组比较△P<0.05；与正常对照组比较#P<0.05

表2 各组大鼠海马区MMP-9和MMP-2的表达

与AD模型组比较*P<0.05；与淫羊藿苷低组比较△P<0.05；与正常对照组比较#P<0.05

与AD模型组比较▲P<0.05；与淫羊藿苷低组比较△P<0.05；与正常对照组比较#P<0.05

图1 Western-blot检测各组血脑屏障紧密链接蛋白ZO-1在海马的表达

3 讨 论

阿尔茨海默病(AD)是老年痴呆的最常见类型， Aβ是各种原因诱发AD的共同通路，是AD形成及发展的关键因素，故常用于AD模型的制造[4]。本研究首先Aβ成功制备AD模型，发现给予淫羊藿苷治疗后，AD大鼠的学习记忆能力有所改善，这与王梅玲的研究相符[5]。淫羊藿苷是中药淫羊藿中的有效成分，属于黄酮类化合物，具有抗肿瘤、增强机体免疫功能、促进造血功能、调节内分泌及抗血栓等功能[2]。Urano等[6]证实，淫羊藿苷能通过抑制炎性因子的表达、降低NO的含量及抑制caspase-3的表达、降低脑组织中AChE活性，并降解Aβ，从而改善AD大鼠学习和记忆障碍。在目前AD的治疗中，对BBB保护是治疗的新靶点[1]。是否淫羊藿苷通过保护BBB通路促进AD神经功能康复呢？国内外尚缺乏相关报道。

血脑屏障是由不同类型的紧密连接蛋白(TJ)组成，其结构显著性的变化为将会引起血脑屏障通透性增加。而ZO-1是与 TJ功能相关的最主要的胞质蛋白，连接跨膜蛋白claudins、occludin的 C-末端至肌动蛋白细胞骨架。ZO-1直接参与调节血脑屏障完整性和功能稳定的基础,ZO-1含量的变化标志着BBB通透性的变化[7]。本实验中给予淫羊藿苷干预后，ZO-1较AD模型组明显增加，特别是高剂量组明显，说明淫羊藿苷能够维护AD大鼠血脑屏障结构和功能上的完整性而发挥脑保护作用。其机制是什么呢？基质金属蛋白酶(MMPs)是一组锌离子依赖性内肽酶家族，

是公认的介导 BBB破坏有关的最主要效应分子[8]。 MMP-9/MMP-2是其家族中的重要成员，被发现在AD及其动物模型中均有不同程度的升高[9]，其分解底物包括中枢神经系统中血脑屏障ZO-1、IV 型胶原、claudins和occludin 等基质，从而起到破坏血脑屏障的作用。本研究发现在AD模型组ZO-1明显较少，而MMP-9/MMP-2表达明显升高，淫羊藿苷干予后MMP-9/MMP-2的表达明显减少，说明淫羊藿苷能通过抑制MMP-9/MMP-2表达对血-脑屏障保护,从而对AD发挥保护作用。越来越多的证据显示，Aβ损伤脑血管内皮细胞随后启动一系列炎症反应连锁效应从而导致血脑屏障破坏可能是AD新的特征性病理改变[1]。现已证实TNF-α、IL -6、炎症介质(NO)和粘附分子等均能促进金属蛋白酶活化的作用[2]，而国内外的研究表面淫羊藿苷对TNF-α 、IL -6、NO和粘附分子等亲炎症细胞因子有不同程度的干预作用[6]，提示淫羊藿苷可能通过调控这些炎性因子参与MMP-9/MMP-2调控从而保护AD血脑屏障通透性。

多靶点调节是中药的主要特点，本研究发现淫羊藿苷通过抑制MMP-9/MMP-2的表达减轻血脑屏障破坏从而保护AD，其机制尚有炎症反应连锁效应参与，还需综合这类因素来研究以进一步完善淫羊藿苷对AD血-脑屏障的保护作用，以期发现其最优疗效，并为临床治疗AD提供更有效的理论依据。

[1]Liu L,Wan W,Xia S,et al.Dysfunctional Wnt/β-catenin signaling contributes to blood-brain barrier breakdown in Alzheimer’s disease[J].Neurochem Int，2014,75:19-25.

[2]李 娌,王学美.淫羊藿苷药理作用研究进展[J].中国中药杂志,2008,33(23)：2727-2731.

[3]Mroczko B,Groblewska M,Barcikowska M.The role of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in the pathophysiology of neurodegeneration:a literature study[J].J Alzheimers Dis,2013,37(2):273-283.

[4]武 一,吉尚戎,蒋伍玲,等.β淀粉样蛋1-40和1-42的聚集性质比较[J].电子显微学报,2003,22(1):21-25.

[5]王梅玲.淫羊藿苷对阿尔茨海默病炎症模型大鼠神经细胞的保护作用[J].中药药理与临床,2014,30(1):42-45

[6]Urano T,Tohda C.Icariin improves memory impairment in Alzheimer’s disease model mice (5xFAD) and attenuates amyloid β-induced neurite atrophy[J].Phytother Res,2010,24(11):1658-63.

[7]Wolburg H,Lippoldt A.Tight junctions of the blood-brain barrier:development,composition and regulation[J].Vascul Pharmacol，2002,38(6):323-337.

[8]Romi F,Helgeland G,Gilhus NE.Serum levels of matrix metalloproteinases:implications in clinical neurology[J].Eur Neurol，2012,67(2):121-128.

[9]郭晓红，卢 宏，牛瑞娜，等.阿尔茨海默病患者血清基质金属蛋白酶2和9水平的测定[J].郑州大学学报,2014,49(1):137-139.

EffectofIcariinonMatrixMetalloproteinasesandbrainbarrierpermeabilityinratswithAlzheimer’sdisease

CHENShijian,SHIShengliang,LIUQianqian,etal.

(DepartmentofNeurology,FourthAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Liuzhou545005,China)

ObjectiveTo explore the effect of Icariin on learning and memory,Metalloproteinases(MMPs) expression and brain barrier permeability of hippocampus region in rats with Alzheimer’s disease(AD).MethodsRats models of Alzheimer’s disease were established by direct β-amyloid protein (Aβ1-42)injection method.For Icariin intervention test，the learning and memory ability was observed.The expressions of MMP-9/MMP-2 were analyzed by and Immunohistochemistry.The brain barrier permeability was detected by measured junction protein (ZO-1) expression.ResultsThe learning and memory ability was obviously decreased in AD model rats.The expression of MMP-9/MMP-2 protein level were was higher compared to control group.After Icariin treatment.The the learning and memory ability was improved,and it could also inhibit the MMP-9/MMP-2 activity(P<0.05) compared to AD model rats,the level of ZO-1 expression was significantly reduced.ConclusionOur result suggests that the protective role of Icariin in AD may be inhibit MMPs activity and maintaining BBB integrity could be another interesting therapeutic target at AD.

Alzheimer’s disease; Icariin; Junction protein (ZO-1); MMP-9/MMP-2

图2 免疫组化检测MMP-9、MMP-2在海马的表达

R749.1

A

1003-2754(2017)10-0922-03

2017-08-12；

2017-10-03

国家自然科学基金(81460813)；广西区计划项目青年基金(Z2015145)

(1.广西医科大学第四附属医院神经内科，广西 柳州 545005;2.广西医科大学第一附属医院神经内科，广西 南宁 530021)