血清饥饿对人白血病细胞株THP-1细胞增殖、细胞死亡和细胞自噬的影响

高 雪,郑晓琦,刘为忠,刘德胜,张 静,潘效红

(滨州医学院药学院细胞工程研究室,烟台 264003;*通讯作者,E-mail:panxiaohong@bzmc.edu.cn)

血清饥饿对人白血病细胞株THP-1细胞增殖、细胞死亡和细胞自噬的影响

高 雪,郑晓琦,刘为忠,刘德胜,张 静,潘效红*

(滨州医学院药学院细胞工程研究室,烟台 264003;*通讯作者,E-mail:panxiaohong@bzmc.edu.cn)

目的 本实验通过血清饥饿处理人急性单核细胞白血病细胞株THP-1,探究血清饥饿对细胞增殖、细胞死亡和细胞自噬的影响及其机制。 方法 实验分为4组:0% FBS组、1% FBS组、5% FBS组和10% FBS组(对照组),血清饥饿时长为24 h和48 h。通过MTT法检测细胞增殖,台盼蓝拒染法检测细胞死亡,流式细胞术测定吖啶橙(AO)的荧光强度,免疫印迹法检测自噬相关蛋白Atg5、 Atg7和LC3Ⅱ表达。 结果 与对照组相比,不同程度血清饥饿处理24 h和48 h均可以显著抑制THP-1细胞增殖(P<0.05),细胞增殖呈现一定的血清浓度依赖性和饥饿时间依赖性。血清饥饿处理24 h和48 h可以显著增加细胞死亡率(P<0.05),并增加细胞内酸性自噬体囊泡的形成。免疫印迹显示,血清饥饿显著性增强自噬相关蛋白Atg5,Atg7和LC3Ⅱ的表达(P<0.05)。 结论 血清饥饿可降低THP-1细胞增殖,增加细胞死亡率和自噬。

THP-1细胞; 血清饥饿; 细胞增殖; 细胞死亡; 细胞自噬

细胞自噬是一种高度保守的细胞降解过程,可将部分胞质和细胞器隔离在自噬溶酶体中进行分解,将分解得到的大分子进行回收利用。自噬在肿瘤发生和治疗中具有重要意义,可以影响肿瘤细胞增殖、侵袭和死亡等方面[1]。自噬对肿瘤细胞的影响是把“双刃剑”:一方面,当肿瘤细胞快速增殖时,细胞会处于营养物质和氧气匮乏的状态。自噬通过及时清除有害物质、破损细胞器和回收可利用物质,为细胞的生存提供合成原料,帮助肿瘤细胞缓解代谢压力,度过营养不足等多种胁迫条件的不利影响。另一方面,当自噬时间过长、细胞数量过多或某些抗肿瘤药物作用时,自噬则会促进细胞死亡[2-4]。急性单核细胞白血病是急性髓细胞白血病的M5亚型,是可引起白血病细胞浸润的造血系统恶性肿瘤,严重危害人类健康。自噬对急性髓细胞白血病同样存在两方面作用:可以维持细胞生存或促进细胞死亡,但白血病发病过程中自噬的作用机制仍不明确。

血清饥饿是指将细胞培养于低血清或无血清的基础培养基中,是常用的细胞饥饿方法。生物机体在饥饿条件下通常可激活自噬过程,通过细胞自我消化、降解及维持细胞内环境的稳定。近年来研究表明,血清饥饿是比全营养素缺失饥饿更好的一种自噬诱导方式,血清饥饿诱导的自噬可以维护细胞增殖和存活[5,6]。本研究以人急性单核细胞白血病THP-1细胞为研究对象,通过检测血清饥饿对细胞增殖、细胞死亡和细胞自噬的影响,为研究白血病细胞自噬与死亡的关系、细胞自噬对细胞生存调控的分子机制等提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 细胞株及主要试剂

人急性单核细胞株THP-1购自武汉博士德生物工程有限公司;MTT粉末、二甲基亚砜(DMSO)、吖啶橙粉末购自美国Sigma-Aldrich公司;RPMI 1640基础液体培养基购自美国Hyclone公司;胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司;台盼蓝染液购自上海碧云天生物技术有限公司;兔抗人Atg5抗体, 兔抗人anti-Atg7抗体, 兔抗人anti-LC3抗体,兔抗人anti-GAPDH抗体和羊抗兔二抗全部购自美国CST公司。

1.2 细胞培养

THP-1细胞生长于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的1640培养基中,在37 ℃、5% CO2、饱和湿度下培养。根据细胞生长情况换液和传代,实验所用细胞均为对数生长期细胞。

1.3 MTT法检测细胞增殖

实验设置0% FBS组、1% FBS组、5% FBS组及10% FBS组(对照组),每组设置5个平行孔。THP-1细胞按密度2×104个/ml接种于96孔板,每孔180 μl细胞液。0% FBS组加入20 μl RPMI 1640基础培养基,其他组分别加入相应浓度血清。培养24 h和48 h,每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml),37 ℃下避光孵育4 h去除溶液,每孔加入100 μl DMSO溶解结晶,酶标仪490 nm处测定吸光度值(A)。

1.4 台盼蓝拒染法检测细胞死亡

细胞按每孔5×104个细胞接种于24孔板中,0% FBS组加入RPMI 1640基础培养基,1%FBS组、5% FBS组和10% FBS组分别加入一定浓度血清。培养24 h和48 h,细胞悬液和0.4%台酚蓝以9 ∶1混合作用10 min,在光镜下细胞计数板计数活细胞和死细胞数量。

1.5 吖啶橙(AO)染色检测自噬溶酶体形成

细胞按每孔5×104个细胞接种于24孔板中,0% FBS组加入RPMI 1 640基础培养基,1%FBS组、5% FBS组和10% FBS组分别加入相应浓度血清培养24 h。收集细胞,用PBS洗涤细胞1次,加入AO染液(使用浓度为1 μg/ml),37 ℃避光染色15 min。用PBS洗涤细胞,并重悬细胞制成单细胞悬液体,流式细胞仪检测各组细胞中荧光强度。

1.6 Western印迹法检测蛋白表达

细胞培养24 h后用RIPA裂解液裂解细胞,提取总蛋白。应用BCA法进行蛋白质定量。制备12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),每孔上样量为80 μg,常规电泳后转移至PVDF膜 (Millipore,Bedford,MA),5%脱脂奶粉常温封闭1 h,加入一抗4 ℃孵育过夜。PBST缓冲液洗涤2次,PBS缓冲液洗涤1次,10 min/次。辣根过氧化物酶标记二抗室温孵育1 h,PBST缓冲液洗涤2次,PBS缓冲液洗涤1次,5 min/次。进行增强化学发光法(ECL)检测,将结果扫描后用QuantityOne软件进行灰度值分析。GAPDH为内参照,目的条带灰度值与内参照灰度值作比较。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 血清饥饿对THP-1细胞增殖的影响

细胞增殖实验设置0% FBS组、1% FBS组、5% FBS组及10% FBS组，其中10% FBS培养条件为细胞正常培养条件，为对照组。MTT法检测表明，细胞培养24 h与对照组相比，0% FBS组的细胞增殖率为47.70%±10.60%，1% FBS组的细胞增殖率为76.55%±1.39%，5% FBS组的细胞增殖率为88.64%±7.41%。细胞培养48 h与对照组相比，0% FBS组的细胞增殖率为16.19%±8.53%，1% FBS组的细胞增殖率为48.71%±2.98%，5% FBS组的细胞增殖率为87.23%±4.51%。血清饥饿24 h和48 h结果显示，血清对细胞增殖有显著影响(P<0.05)，呈现血清浓度依赖性。血清浓度越高，细胞增殖能力越强。对0% FBS组和1% FBS组来说，血清饥饿对细胞增殖也有时间依赖性，血清饥饿时间越长，细胞增殖能力越弱。对10% FBS组来说，血清饥饿对细胞增殖没有显著时间依赖性(见图1)。

组间比较，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001，ns表示P>0.05图1 血清饥饿对THP-1细胞增殖的影响Figure 1 The effects of serum deprivation on cell proliferation in THP-1 cells

2.2 血清饥饿对THP-1细胞存活的影响

台盼蓝拒染法结果显示，细胞培养24 h，0% FBS组的细胞死亡率为(81.89±2.50)%，1% FBS组的细胞死亡率为(55.56±9.62)%，5% FBS组的细胞死亡率为(13.94±5.9)%，10% FBS组的细胞死亡率为(13.89±9.77)%。细胞培养48 h，0% FBS组的细胞死亡率为(95.83±7.22)%，1% FBS组的细胞死亡率为(62.17±4.65)%，5% FBS组的细胞死亡率为(10.13±2.34)%，10% FBS组的细胞死亡率为(3.11±2.72)%(见图2)。 因此，血清含量影响THP-1细胞存活能力，血清含量不足，可显著增加细胞死亡率(P<0.05)。

组间比较，*P<0.05,**P<0.01，ns表示P>0.05图2 血清饥饿对THP-1细胞死亡率的影响Figure 2 The effects of serum deprivation on cell death in THP-1 cells

2.3 血清饥饿对THP-1细胞自噬的影响

通过流式细胞法检测吖啶橙荧光强度显示，细胞培养24 h，0% FBS组的平均荧光强度为(93.43±1.40)%，1% FBS组的平均荧光强度为(87.17±1.96)%，5% FBS组的平均荧光强度为(67.80±2.71)%，10% FBS组的平均荧光强度为(53.33±2.89)%(见图3)。 结果显示血清饥饿可诱导THP-1细胞自噬发生，并呈现血清浓度依赖性。

组间比较，*P<0.05,**P<0.01图3 血清饥饿对THP-1细胞内荧光强度的影响Figure 3 The effects of serum deprivation on intensity of AO in THP-1 cells

2.4 血清饥饿对自噬相关蛋白表达的影响

Western blot实验结果显示与对照组相比，0% FBS组LC3Ⅱ表达显著增强(P<0.05)，随着血清浓度增加，LC3Ⅱ表达降低，但10% FBS组表达与1% FBS组相近，无统计学差异。 检测Atg5蛋白结果显示，0% FBS组表达增强(P<0.05)，1% FBS组和5% FBS组表达无显著性差异，10% FBS组表达最低(见图4)。检测Atg7蛋白结果显示，0% FBS组表达增强(P<0.05)，随着血清浓度增加，Atg7表达显著降低。

3 讨论

细胞自噬是真核生物中普遍存在的、对细胞生长及死亡的重要调控机制,与肿瘤等多种人类疾病有关。自噬对肿瘤发生发展的作用非常复杂,常表现为两面性:一方面,自噬是细胞针对多种胁迫条件(如营养限制和氧化胁迫)的一种细胞应答过程;另一方面,自噬又是促进细胞死亡的主要原因[5,7]。白血病是以白血病细胞的异常增殖,在脏器的广泛浸润等临床表现为主的造血系统性肿瘤。根据白血病细胞的成熟程度,可将白血病分为急性和慢性两大类。人急性单核细胞白血病是急性髓细胞白血病的M5亚型,有骨髓衰竭和细胞浸润等症状[8]。现已知的药物、维生素、光损伤等均可诱导白血病细胞发生自噬性死亡,进而起到杀死癌细胞的作用[9-11]。本实验通过血清饥饿方式诱导细胞发生自噬,从而探究血清饥饿与细胞生存和细胞自噬之间的关联。

组间比较，*P<0.05,**P<0. 01,***P<0.001，ns表示P>0.005图4 血清饥饿对自噬相关蛋白Atg5,Atg7和LC3Ⅱ表达的影响Figure 4 The effect of serum deprivation on the expression of Atg5,Atg7 and LC3Ⅱ in THP-1 cells

诱导细胞自噬的饥饿处理中包括很多方式,包括全营养素剥夺、血清饥饿及氨基酸饥饿等。其中血清饥饿是在细胞培养过程中使用了不含血清成分的基础培养基,使细胞缺乏血清中含有的营养物质,导致细胞饥饿的方法,此方法避免了细胞能量供应不足而产生的细胞损伤。本研究显示,血清饥饿可抑制THP-1细胞增殖,且呈一定血清浓度依赖性和作用时间依赖性。本研究通过MTT法检测体外增殖发现,血清浓度对细胞增殖影响明显。血清饥饿24 h, 5% FBS组的增殖与对照组相比无显著性差异,饥饿24 h时中浓度血清可维持THP-1细胞的增殖,但饥饿48 h时中浓度血清不足以维持细胞正常增殖,表明中浓度血清培养条件可能是通过自噬进行营养物质的回收利用来保持细胞的增殖状态。台盼蓝拒染法结果显示,血清饥饿处理24 h时,0% FBS组和1% FBS组中,细胞死亡率较高,而5% FBS组和10% FBS组细胞死亡率无显著性差异。从理论上讲,5% FBS组含有少量营养和生长因子,短时间能维持细胞生存,细胞死亡率与对照组相比无显著性差异,表明短时间的血清浓度不足,细胞发挥其内在机制可以维持细胞生存。因此,本研究猜测,一定浓度和一定时间的血清饥饿可能诱导细胞自噬等机制维持细胞生存。

吖啶橙是一种显荧光的碱性染料,可与细胞内酸性小泡融合,细胞内含有自噬溶酶体可被吖啶橙染色。 本实验将细胞用吖啶橙染色后进行流式细胞法检测细胞荧光强度,结果显示血清饥饿处理能显著性增强细胞荧光强度,且随着血清浓度增加,细胞荧光强度降低。表明THP-1细胞在血清不足的情况下,通过自噬来维持细胞的存活。自噬发生过程中,一些自噬相关基因(autophagy related gene,Atg)的表达对自噬调控有重要作用[12,13]。Atg5是参与形成自噬体的重要基因,对自噬发生起重要调节作用[14,15]。在自噬泡形成的早期阶段,Atg5与Atg12和Atg16L形成复合物,促进了自噬泡的伸展和扩张;此外,Atg5复合物的形成还促进了LC3向自噬泡的移动[16]。本实验Western blot结果显示,血清饥饿处理能显著增强Atg5的表达,表明血清饥饿能通过促进自噬体的形成促进自噬的进程。Atg7可诱导本底水平自噬发生,也可与Atg5-Atg12形成复合物,在自噬早期起决定性作用[17]。Atg7还参与催化LC3Ⅰ形成LC3Ⅱ,LC3Ⅱ是自噬体的标志分子,在自噬泡的形成中起重要作用[18,19]。结果显示,血清饥饿能显著增强Atg7和LC3Ⅱ的表达,表明血清饥饿可通过增强Atg7的表达来促进LC3Ⅰ形成LC3Ⅱ。本实验也显示,THP-1细胞具有本底水平的自噬发生,可能是细胞通过自噬来更新长寿命蛋白,去除受损的细胞器。

综上所述,血清饥饿可显著抑制人急性单核细胞白血病细胞株THP-1细胞增殖,增加细胞死亡率,诱导细胞发生自噬。血清诱导的自噬主要是通过调控自噬相关基因Atg5,Atg7和LC3Ⅱ表达来实现的。当THP-1细胞处于完全血清饥饿环境中,细胞自噬的发生不足以维持细胞生存或可以促进细胞死亡,当THP-1细胞处于低浓度血清或中浓度血清环境中,细胞自噬的发生可以维持细胞的存活。对急性髓细胞白血病中自噬发生机制的研究,可为白血病发病机制和靶向治疗提供依据和新的研究方向。

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Effectsofserumdeprivationoncellproliferation,celldeathandautophagyinhumanleukemiacelllineTHP-1

GAO Xue, ZHENG Xiaoqi, LIU Weizhong, LIU Desheng, ZHANG Jing, PAN Xiaohong*

(CellEngineeringLaboratory,CollegeofPharmaceuticalSciences,BinzhouMedicalUniversity,Yantai264003,China;*Correspondingauthor,E-mail:panxiaohong@bzmc.edu.cn)

ObjectiveTo investigate the effects of serum deprivation on cell proliferation, cell death and autophagy in human monocytic leukemia cell line THP-1.MethodsExperiments were divided into four groups: 0% FBS group, 1% FBS group, 5% FBS and 10% FBS group(control group), and cells were starved for 24 h and 48 h. Cell proliferation was performed by MTT assay. Cell death was tested by trypan blue exclusion assay. Fluorescence intensity of acridine orange(AO) was examined by a flow cytometer. Western blot was performed for investigating the expression of autophagy-related genes at the protein level.ResultsThe serum deprivation significantly inhibited cell proliferation in a concentration-dependent and time-dependent manner after FBS treatment(P<0.05). And serum deprivation significantly increased cell death and the fluorescence intensity of acid autolysosome(P<0.05). Serum deprivation signifi cantly increased the expression of Atg5, Atg7 and LC3Ⅱ(P<0.05).ConclusionSerum deprivation can inhibit the cell proliferation, induce cell death and autophagy of THP-1 cells.

THP-1 cells; serum deprivation; cell proliferation; cell death; autophagy

Q279

A

1007-6611(2017)10-1003-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.10.006

国家自然科学基金资助项目(81573412，31270082);山东省自然科学基金资助项目(ZR2014JL055，ZR2013HM042);滨州医学院科研启动基金资助项目(BY2015KYQD03)

高雪,女,1985-01生,博士,讲师,E-mail:gxue160304@bzmc.edu.cn

2017-07-31