大鼠海马和杏仁核电点燃癫痫模型的比较

马新财,孙蒙蒙,呼奶英,王德广

(徐州医科大学人体解剖学教研室,徐州 221004;*通讯作者,E-mail:2371169525@qq.com)

大鼠海马和杏仁核电点燃癫痫模型的比较

马新财,孙蒙蒙,呼奶英,王德广*

(徐州医科大学人体解剖学教研室,徐州 221004;*通讯作者,E-mail:2371169525@qq.com)

目的 比较大鼠海马和杏仁核电刺激癫痫模型,探讨不同类型癫痫的病理机制。 方法 将健康成年雄性Sprague Dawley大鼠40只,随机分为海马癫痫模型组(EP-Hi组,n=16)、杏仁核癫痫模型组(EP-PAmy组,n=16)、假手术组(仅麻醉后切开头皮,插入电极但不做电刺激,n=8)。海马和杏仁核模型进行电刺激,观察大鼠的行为学表现;完全点燃之后2 h和35 d,将所有的实验大鼠用免疫组化法检测脑组织内c-Fos、NeuN的表达。 结果 行为学检测:杏仁核癫痫模型组(EP-PAmy)的发作症状较海马癫痫模型组(EP-Hi)典型;免疫组化结果显示,与sham组相比,EP-PAmy组和EP-Hi组海马各区及皮质各区c-Fos阳性表达细胞数均明显增多(P<0.05),EP-Hi组海马各区c-Fos阳性表达细胞数明显高于EP-PAmy组(P<0.05),而皮质各区c-Fos阳性表达细胞数增加的程度较低(P<0.05);与sham组相比,EP-PAmy组和EP-Hi组海马及皮质各区神经元核蛋白(NeuN)阳性表达细胞数明显减少(P<0.05),EP-Hi组海马各区NeuN阳性表达细胞数明显低于EP-PAmy组(P<0.05),而皮质各区NeuN阳性表达细胞数减少的程度较低(P<0.05)。 结论 电刺激EP-PAmy的发作以及c-Fos、NeuN在海马各区和皮质各区的表达与EP-Hi是有差异的,从而表明EP-PAmy的神经环路对脑区的影响与EP-Hi不同。

癫痫; 动物模型; 电刺激; c-Fos; 神经核蛋白

癫痫是神经系统常见病,癫痫的发生与多种因素相关,为了阐明其发病机制,癫痫模型的建立起着重要作用[1]。而电点燃动物边缘脑区的某一部位是建立癫痫动物模型的一种比较经典的方法。以同等强度的阈下刺激在一定的时间间隔下重复刺激同一脑区,使痫性活动强度逐渐增加,最终导致全身性癫痫[2]。电点燃形成后,即使不再给予刺激,异常的病性放电可以持续很长时间,甚至终生,这与人类癫痫发生与形成极为相似[3,4]。海马和杏仁核癫痫电刺激模型是研究癫痫发病机制的重要模型,但是对于二者的比较尚未见报道。本研究对电点燃大鼠海马与点燃杏仁核癫痫模型进行比较,希望进一步探讨不同类型癫痫的病理机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠40只,体质量200-300 g,清洁级,由徐州医科大学实验动物中心提供,动物实验经徐州医学院动物伦理委员会批准(编号:SCXK(SU)2010-0003)

1.2 主要试剂与仪器

多聚甲醛购自天津永大化学试剂厂;兔抗c-Fos多克隆抗体购自美国SantaCruz公司;鼠抗NeuN多克隆抗体购自美国SantaCruz公司;生物素化羊抗兔IgG(二抗)购自北京中杉金桥生物工程有限公司;生物素化羊抗鼠IgG(二抗)购自北京中杉金桥生物工程有限公司。脑立体定位仪购自美国Stoelting公司;KD-Ⅵ电脑快速冷冻石蜡切片机购自浙江省金华市科迪仪器设备有限公司;YLS-9A生理、药理电子刺激仪购自北京众实迪创科技发展有限责任公司;显微摄像系统(DP71)购自日本奥林巴斯株式会。

1.3 实验大鼠分组

根据随机数字表法将其分为3组:①手术对照组(n=8),仅麻醉后切开头皮,插入电极,但不做电刺激;②杏仁核电刺激癫痫模型组(n=16),分为点燃后2 h处理组(n=8)和35 d(n=8)处理组;③海马电刺激癫痫模型组(n=16),分为点燃后2 h处理组(n=8)和35 d处理组(n=8)。

1.4 大鼠杏仁核和海马电点燃癫痫模型的制作

实验大鼠使用10%水合氯醛(0.35 mg/100 g)腹腔注射实施麻醉,同时腹腔注射安定(0.01 ml/100 g),固定于大鼠立体定位仪上,根据Paxinos等[3]及王平宇教授大鼠脑图谱[4]分别对杏仁核和海马进行立体解剖定位:杏仁核植入电极位置(AP-2.0 mm,ML 5.0 mm,DV-8.3 mm);海马CA1植入电极位置(AP-3.5 mm,ML±2.0 mm,DV-3.0 mm),电钻打孔,植入电极,牙科水泥固定电极和刺激电极接头。

术后大鼠恢复1周,第8天始采用恒流分别电刺激杏仁核和海马CA1,隔日一次,刺激参数为恒流电双相方波,波宽l ms,频率为60 Hz,持续时间1 s,经过多次的实验摸索,最终确定了两者刺激的电流范围,杏仁核开始予以0.01 mA电流强度刺激,如果动物没有反应,分别使用0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07 mA刺激,直至动物出现Ⅴ级癫痫发作,动物出现Ⅴ级癫痫的电流刺激是(0.025±0.005)mA;海马CA1开始予以0.07 mA电流强度刺激,如果动物没有反应,分别使用0.07,0.09,0.11,0.12,0.13,0.14,0.15 mA刺激,直至动物出现Ⅴ级癫痫发作,动物出现Ⅴ级癫痫的电流刺激是(0.11±0.005)mA。动物在电刺激杏仁核和海马CA1后的行为变化参考Racine法分级记录动物行为变化(见表1),其中Ⅳ、Ⅴ级发作为继发性全身性癫痫模型,如果动物连续3次出现Ⅴ级发作,即被完全点燃(kindled),可用于下述试验。

表1电点燃Racine法分级

Table1Racinegradingofelectricignition

分级 发作表现Ⅰ湿狗样颤动,面肌抽动,咀嚼Ⅱ节律点头Ⅲ单侧前肢阵挛Ⅳ站立并伴双侧前肢阵挛Ⅴ持续站立和倾倒,失平衡,四肢抽动

1.5 形态学分析和免疫组织化学染色

杏仁核和海马CA1末次急性电点燃癫痫全身发作后2 h、35 d,用10%水合氯醛对大鼠行腹腔注射麻醉,生理盐水和4%的多聚甲醛经左心室灌注固定脑组织,然后断头取脑,将取出的鼠脑放置在4%多聚甲醛中于4 ℃冰箱中后固定24-48 h,随后移入30%蔗糖溶液中直至沉底,做连续冰冻切片,发作后2 h处理组给予c-Fos免疫组织化学染色,发作后35 d处理组给予NeuN免疫组织化学染色,应用Olympus光学显微镜及其PM-CB20显微照相系统进行观察。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 动物行为学表现

参考Racine法分级记录动物行为变化:杏仁核电刺激癫痫模型较海马电刺激癫痫模型易刺激出癫痫发作;杏仁核电刺激癫痫模型癫痫发作时,发作持续时间较海马电刺激癫痫模型短;杏仁核电刺激癫痫模型癫痫发作过后,大鼠很快恢复如常,而海马电刺激癫痫模型癫痫发作过后,仍表现烦躁不安,四处走动。

2.2 c-Fos表达脑区差异

c-Fos阳性表达神经元为胞核呈棕褐色,胞质不着色,大鼠杏仁核和海马CA1急性电点燃成功后两组海马CA1、CA3和DG(齿状回)的表达均高于对照组(见图1,表2),与对照组比较均有统计学差异(P<0.05),大脑皮质额皮质(Fr)、压部后皮质(RS)、皮质后肢区(HL)和顶皮质(Par)的表达均明显高于对照组(P<0.05),EP-Hi组与EP-PAmy组相比,海马各区c-Fos阳性表达细胞数明显较多(P<0.05),而皮质各区c-Fos阳性表达细胞数较少(P<0.05，见图2,表3)。

EP-Hi组和EP-PAmy组CA1、CA3和DG区的c-Fos表达均高于对照组,EP-Hi组与EP-PAmy组相比,CA1、CA3和DG区c-Fos阳性表达细胞数明显较多。图1 杏仁核和海马电点燃癫痫模型海马各区c-Fos表达情况Figure 1 Expression of c-Fos in hippocampus of amygdala and hippocampus in epilepsy model

组别CA1区CA3区DG区 对照组8.6±2.023.3±2.535.3±3.2 EP-PAmy组27.0±3.6*50.3±6.1*232.6±7.6* EP-Hi组51.3±3.7*#75.0±6.2*#273.0±6.0*#

与对照组比较,*P<0.05;与EP-PAmy组比较,#P<0.05

组别FrRSEnt 对照组24.0±5.032.0±4.025.0±4.6 EP-Hi组39.0±3.6*40.3±4.5*56.0±6.0* EP-PAmy组54.3±5.8*#69.0±6.5*#86.3±9.3*#

与对照组比较,*P<0.05;与EP-Hi组比较,#P<0.05

2.3 NeuN表达脑区差异

NeuN阳性表达神经元为胞核着色呈棕褐色,神经元核蛋白(NeuN)免疫组织化学染色结果显示在海马及皮质各区EP-PAmy组和EP-Hi组与对照组相比,NeuN阳性表达细胞数均明显减少(P<0.05，见图3,表4),EP-Hi组与EP-PAmy组相比,海马各区NeuN阳性表达细胞数均明显减少(P<0.05),而皮质各区NeuN阳性表达细胞数增加(P<0.05,见图4,表5)。

组别 CA1CA3 DG 对照组352.3±33.8376.0±25.2478.0±27.0 EP-PAmy组232.0±23.7*251.3±16.3*284.6±17.8* EP-Hi组119.6±11.5*#93.3±22.7*#147.3±13.4*#

与对照组比较,*P<0.05;与EP-PAmy组比较,#P<0.05

EP-Hi组和EP-PAmy组Fr、RS和Ent皮质区的c-Fos表达均高于对照组,EP-PAmy组与EP-Hi相比,Fr、RS和Ent区c-Fos阳性表达细胞数明显较多图2 杏仁核和海马电点燃癫痫模型皮质各区c-Fos表达情况Figure 2 Expression of c-Fos in the cortex of the amygdala and hippocampusepilepsy model

EP-Hi组和EP-PAmy组CA1、CA3和DG区的NeuN阳性表达细胞数表达均低于对照组,EP-PAmy组与EP-Hi组相比,CA1、CA3和DG区NeuN阳性表达细胞数明显较多图3 杏仁核和海马电点燃癫痫模型海马各区NeuN表达情况Figure 3 Expression of NeuN in the hippocampus of the amygdala and hippocampus in the epilepsy model

EP-Hi组和EP-PAmy组Fr、RS、Par和PAmy皮质区的NeuN阳性表达细胞数均低于对照组,EP-Hi组与PAmy相比,Fr、RS、Par和杏仁核周皮质(PAmy)区NeuN阳性表达细胞数明显较多。图4 杏仁核和海马电点燃癫痫模型皮质各区NeuN表达情况Figure 4 Expression of NeuN in the cortex of the amygdala and hippocampus epilepsy model

组别RSHLParPAmy 对照组952.3±60.8646.0±36.1737.3±29.5688.5±28.3 EP-Hi组632.0±43.6*490.3±38.5*572.7±26.7*486.0±47.0* EP-PAmy组456.0±35.0*#223.0±45.0*#482.3±43.5*#227.0±23.6*#

与对照组比较,*P<0.05;与EP-Hi组比较,#P<0.05

3 讨论

本次实验行为学检测中,参考Racine法分级记录动物行为电刺激杏仁核癫痫模型较海马癫痫模型易点燃,发作症状较海马癫痫模型典型。有研究报道在电刺激传递过程中,杏仁核海马纤维通过邻近的颞叶白质形成更直接通路[5],从而支持了EP-PAmy较EP-Hi易点燃的实验结果。

c-Fos蛋白是c-Fos基因转录产生的成熟mRNA编码的一个核磷蛋白。当受到如癫痫发作、脑缺血、恐惧和愤怒应激等刺激后,其在数分钟内做出反应,导致中枢神经系统不同区域出现不同数量的蛋白表达[7，8],c-Fos蛋白作为中枢神经系统功能活动的代谢标志物,它已被广泛的应用于癫痫的定位示踪,机理探讨,评价不同类型癫痫神经环路差异中发挥重要作用[9]。

本实验结果表明,杏仁核和海马点燃后2 h脑内不同核团c-Fos蛋白表达存部位的差异性。EP-Hi组与EP-PAmy组相比,海马各区c-Fos阳性表达细胞数均明显增多,而皮质各区c-Fos阳性表达细胞数均减少,国外作者证实,紧挨着杏仁核的梨状皮质在EP-PAmy电刺激中是最早活跃的部位,认为EP-PAmy癫痫标志的发作间期后放电,起源于梨状皮质[9],梨状皮质与杏仁核之间有着广泛的纤维联系,因此刺激杏仁核时其神经信号通过纤维联系由近及远地传播,先传递到近距离的梨状皮质,而梨状皮质的内嗅区是海马传入纤维的重要起源处,而齿状回则作为海马结构的传入门户,接受内嗅皮质的传入,从而刺激传到齿状回,再传至海马结构,由于海马与皮质之间有广泛联系,因此通过海马,神经信号又传到皮质。在EP-Hi海马各区中齿状回(DG)门区的c-Fos阳性表达细胞数是最多,可能DG是EP-Hi的起搏点,因此EP-Hi的传播通路是齿状回、海马结构、皮质。上述结论侧面支持了我们的实验结果。

神经元核蛋白(NeuN)是一种神经组织特异的蛋白,是成熟神经元的标记物[10]。在癫痫疾病中,NeuN在脑组织的表达可以反映脑组织中神经元的损伤和存活情况[11]。

在本次实验中,大鼠全面性发作后35 d,神经元核蛋白(NeuN)免疫组织化学染色结果显示在海马及皮质各区EP-PAmy组和EP-Hi组与对照组相比,NeuN阳性表达细胞数均明显减少,可表明神经元有明显的缺失。有学者报道神经元的缺失在全面发作3次后就可出现,其机制包括兴奋性氨基酸的毒害作用,代谢异常,钙离子超载,凋亡基因的启动等[12]。海马和齿状回不同类型的神经元群体对边缘系统的兴奋性起不同的影响作用:颗粒细胞对点燃起促进作用,CA1、CA3区锥体细胞和齿状回门区神经元可抑制点燃。然而,在本实验中,癫痫发作组动物神经元缺失现象明显,而且EP-PAmy组和EP-Hi组区域缺失程度具有差异:EP-Hi组与EP-PAmy组相比,海马各区NeuN、MAP2阳性表达细胞数均明显减少,而皮质各区NeuN阳性表达细胞数均增加,从而表明对点燃起促进作用的颗粒细胞相对保留,起抑制作用的CA1、CA3、齿状回(DG)门区的神经元缺失最为突出,考虑是由于这些区域神经元表面兴奋性谷氨酸受体数目多,另外含细胞器较多的抑制性神经元比重大,代谢率高,最易受损[13]。这种选择性的神经元缺失,破坏了中枢兴奋和抑制功能的平衡。

综上所述,本实验通过对杏仁核和海马电刺激癫痫模型的比较,在刺激过程中两者行为学表现不同、c-Fos蛋白、NeuN的表达不同,杏仁核和海马电刺激癫痫模型产生癫痫的环路的位置不同,以及对脑的影响不同,从而对探讨不同类型癫痫的病理机制有一定的启示作用。

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Comparisonofepilepsymodelsinducedbyelectricalstimulationinhippocampusandamygdalaofrats

MA Xincai, SUN Mengmeng, HU Naiying,WANG Deguang*

(DepartmentofHumanAnatomy,XuzhouMedicalUniversity,Xuzhou221004,China;*Correspondingauthor,E-mail:2371169525@qq.com)

ObjectiveTo compare the kindled epilepsy models of hippocampus and amygdala and to explore the pathological mechanism of different types of epilepsy.MethodsForty healthy adult male Sprague Dawley rats were randomly divided into epilepsy model of hippocampus group(EP-Hi group,n=16),epilepsy model of amygdala group(EP-PAmy group,n=16), sham group(n=8). The hippocampal and amygdala epilepsy models were electrically stimulated to observe the behavioral performance of rats. At 2 h and 35 d after electrical kindling, all experimental rats were perfused with 4% paraformaldehyde and the brain tissues were taken. The expression of c-Fos and neuronal nucleoprotein(NeuN) was detected by immunohistochemical staining.ResultsThe symptoms of the epilepsy model of periamygdaloid(EP-PAmy) were more typical than that of the epilepsy model of hippocampus(EP-Hi). Compared with sham group, the number of c-Fos positive cells by immunohistochemical staining were increased significantly in the hippocampus and cortex in EP-PAmy group and EP-Hi group(P<0.05).The number of c-Fos positive cells in hippocampus in EP-Hi group was significantly higher than that in EP-PAmy group(P<0.05), while the number of c-Fos positive cells in cortical regions in EP-Hi group was significantly lower than that in EP-PAmy group(P<0.05). Compared with sham group, the number of NeuN positive cells by immunohistochemical staining in the hippocampus and cortex were decreased significantly in EP-PAmy group and EP-Hi group(P<0.05).The number of NeuN positive cells in the hippocampus was significantly lower in EP-Hi group than in EP-PAmy group(P<0.05), while the number of NeuN positive cells in cortical regions was significantly higher in EP-Hi group than in EP-PAmy group(P<0.05).ConclusionThe symptoms and the expression of c-Fos and NeuN in the hippocampus and cortex of EP-PAmy are different from those of EP-Hi, which suggests that the neural loop and the effect of EP-PAmy on the brain are different from those of EP-Hi.

epilepsy; animal model; electrical stimulation; c-Fos; neuronal nucleoprotein

R742.1

A

1007-6611(2017)10-0986-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.10.003

马新财,男,1988-07生,硕士

2017-04-11