前交叉韧带重建早期移植肌腱的生物力学和关节滑液中IL-1β的变化

董向辉,孙正明,靳占奎,常彦海,杨 波,凌 鸣

(陕西省人民医院骨科,西安交通大学医学院第三附属医院,西安 710068;*通讯作者,E-mail:m.ling0114@163.com)

前交叉韧带重建早期移植肌腱的生物力学和关节滑液中IL-1β的变化

董向辉,孙正明,靳占奎,常彦海,杨 波,凌 鸣*

(陕西省人民医院骨科,西安交通大学医学院第三附属医院,西安 710068;*通讯作者,E-mail:m.ling0114@163.com)

目的 建立兔前交叉韧带(anterior cruciate ligament,ACL)重建模型,探讨术后早期关节滑液中白细胞介素1β的表达水平及移植肌腱生物力学变化的关系。 方法 25只成年新西兰大白兔,一侧后肢作为实验组,使用同侧踇长伸肌腱建立前交叉韧带重建模型,对侧作为正常对照组,于术后2，4，6周分别处死,测定移植肌腱的生物力学变化,并用ELISA法检测关节滑液中白细胞介素1β的表达水平。 结果 ELISA测定结果显示,实验组IL-1β水平在术后第2周达到高峰后逐渐下降,第6周接近正常水平。术后2,4,6周实验组韧带断裂所需拉力明显低于正常对照组(P<0.01),术后重建韧带强度急剧下降,4周末时达到最低,后强度逐渐升高。 结论 前交叉韧带重建手术后关节滑液中IL-1β的水平变化对移植物生物力学强度产生不利影响,提示降低关节内IL-1β水平是改善移植肌腱生物力学强度的积极因素之一。

白细胞介素1β; 前交叉韧带重建; 踇长伸肌腱; 生物力学

前交叉韧带(ACL)损伤是比较常见的一种运动损伤,主要特征就是损伤后绝大多数患者因为疼痛不明显、误诊或者被其他伴发疾病所掩盖等原因,多数患者延误早期治疗,进而发展为膝关节不稳定,最终结局为骨关节炎[1,2]。ACL缺乏血液供应,营养主要来自滑液和腱周组织,损伤后不能自行愈合,需要手术重建[3],但是手术后各种因素影响其愈合,如重建肌腱的血供、神经营养问题、关节滑液和其中炎症产物的影响等。IL-1作为最经典的炎症反应调节剂,分为两种亚型,主要是以IL-1β为主发挥其病理生理效应,本实验在ACL重建基础上,探索术后早期关节滑液中IL-1β的表达水平及移植肌腱的生物力学变化及其关系。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

选取健康成年[(11.0±2.5)月]雄性新西兰大白兔25只,体质量3-3.5 kg,由西安交通大学医学院动物实验中心提供并饲养,由实验中心统一提供标准颗粒饲料,饲养温度22-25 ℃,湿度40%-60%,分笼饲养,自由活动,饲养室内每日定时紫外线消毒。所有动物术前观察活动正常,膝关节无肿胀畸形,双膝关节抽屉试验、Lachman征均阴性。每只动物均建立以同侧踇长伸肌腱为移植物的ACL重建模型,以此作为实验组,对侧膝为正常对照组。为避免实验中标本死亡、手术失败等原因导致的数据丢失,额外饲养2只兔子并制成上述模型以保证有效标本量。

1.2 主要试剂及仪器

兔IL-1β ELISA试剂盒购自R&D公司(美国),WDW-100微机控制电子万能生物力学试验机采用西安交通大学航空航天学院力学实验室仪器。

1.3 动物模型建立

术前准备:用动物固定架将兔子固定稳妥,3.3%戊巴比妥钠(1 ml/kg)溶液耳缘静脉注射行全身麻醉,待呼吸、心跳平稳,全身肌肉松弛后将其仰卧于手术台上,用硫化钠脱毛剂脱去膝关节周围的兔毛,给予青霉素40万单位肌肉注射预防感染。

建立模型:常规消毒铺巾单,膝关节微屈位,取膝关节前正中切口,显露膝关节前交叉韧带,在股骨、胫骨附着处切断,检查抽屉试验前拉及Lachman征均为阳性,证明前交叉韧带已完整切除。

取胫骨下段内侧纵形切口,约2 cm,分离并取出踇长伸肌肌腱,剔除肌肉后对折成双股,两端慕丝线编织,并在两端保留8 cm长的缝线,预张10 min后浸泡在生理盐水中备用,冲洗缝合切口。所取肌腱测量并记录肌腱直径。

屈膝45°,用直径1 mm的克氏针以原ACL起止点为标志分别钻取胫骨、股骨骨道,选取与测量肌腱直径相近的钻头沿克氏针方向分别扩大胫骨及股骨髓道,并在骨道出口处钻取骨桥,将移植肌腱依次穿过胫骨、股骨髓道,屈膝60°将牵引线穿过骨桥牢固打结固定,再次检查抽屉试验及Lachman征均为阴性,用双氧水及生理盐水彻底冲洗伤口及关节周围,严密缝合切口,碘伏消毒后包扎,术后分笼饲养,自由活动,每天伤口处碘伏消毒,并给予青霉素(40万单位)肌肉注射,连续5 d,预防感染。术后1只死亡,1只伤口感染,备用补充保证样本量。

1.4 留取标本

1.5 生物力学测定

用WDW-100微机控制电子万能生物力学试验机进行测试,固定好后进行最大载荷拉伸试验,加载速度为5 mm/min,详细观察并记录前交叉韧带完全断裂时的加载负荷。

1.6 ELISA法测定滑液中IL-1β含量

使用ELISA法进行关节滑液中IL-1β的水平测定,注意事项:在同一实验条件下进行;试剂盒应该平衡至室温下再进行实验;使用前所有试剂充分混匀,不要产生气泡,以免造成加样误差;每个标准品和空白孔均做复孔;底物使用液必须新鲜配制。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 生物力学测定结果

术后2，4周生物力学测试时实验组各5例标本全部从骨髓道内脱出,重新夹持后测定,直至重建韧带断裂为止,6周时实验组2例自骨髓道拔出,其余3例在韧带体部断裂,肉眼观察可见肌腱体部中央处较两端略细(4周时最细),表面少量滑膜局限覆盖,未见明显血管生成,肌腱有部分被溶解吸收。

与对照组相比较,在各个时间点实验组韧带断裂所需拉力显著低于对照组(P<0.01,见表1)。术后重建韧带最大载荷急剧下降,在第4周末达到最低,随后强度逐渐升高。

表1ACL重建术后不同时间两组移植肌腱完全断裂所需拉力

分组2周4周6周实验组 41.62±1.64* 21.19±0.88* 44.64±1.63*对照组181.67±6.77177.17±8.52176.17±6.62

与对照组相比,*P<0.01

术后2,4,6周实验组韧带断裂所需拉力分别占正常ACL(对照组)的23%，12.2%，25.6%。

2.2 ELISA测定结果

术后第1,2,3,4,6周关节滑液中IL-1β ELISA法定量测定结果显示:实验组关节滑液中IL-1β水平在各个时间点均与对照组比较差异存在统计学意义(P<0.01,见表2),ACL重建术后关节滑液中IL-1β水平逐渐增高,在手术后第2周末达到最高峰,后逐渐下降,但是仍维持在高水平,第6周时接近正常(见表2)。

分组1周 2周 3周 4周 6周 实验组38.17±1.25**98.98±1.61**59.70±1.95**31.78±1.41**15.34±0.93*对照组10.25±0.2510.25±0.90 9.74±1.0010.30±0.4910.25±1.12

与对照组相比,*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

ACL重建手术后移植物在生物力学上经历了由强急剧减弱,再逐渐增强的过程[4-6],移植物在早期由于缺乏血液供应而逐渐坏死,强度急剧减弱,此后随着新生血管和胶原纤维长入替代,强度逐渐增加,经过这一系列过程,最终成为在力学和组织学上接近正常ACL的替代韧带[7],移植物与骨髓道之间的腱骨愈合过程复杂、影响因素较多,比如移植物的种类、微动和应力、固定的方式、炎性细胞因子和关节滑液的浸泡、骨髓道位置等[8],因此在术后的各个阶段受到不利影响均会对术后效果产生负面效应,因此早期、合理的治疗和处理会对患者产生积极的影响。本实验通过在ACL重建基础上,探索术后早期IL-1β的表达水平及移植物生物力学变化及其关系。

IL-1作为最经典的炎症反应调节剂,分为IL-1α和IL-1β两种亚型,以IL-1β为主,共同作用于同一个受体,发挥类似的生物学活性,在炎症反应的发生、发展和结束过程中均起到重要作用[9]。IL-1受体拮抗蛋白(IL-1Ra)是IL-1的天然拮抗剂,由滑膜细胞、软骨细胞分泌,与IL-1竞争性结合滑膜细胞膜表面的IL-1受体,进而阻断其生物学活性。陈游等[10]发现在不同病变程度的OA患者中IL-1β水平与病情正相关,提示IL-1β会对关节内结构产生破坏作用。Henderson等[11]向兔关节腔内注射IL-1,结果导致了与兔膝关节软骨基质中蛋白多糖的丢失相关联的滑膜组织炎症,通过向兔关节腔内注射IL-1Ra,不但抑制软骨基质中蛋白多糖的丢失,而且有效地抑制了滑膜炎症,明显减轻关节内炎症反应,但是它在体内的半衰期很短,只有几个小时,每天注射才能取得肯定的疗效。ACL重建手术后,滑膜组织明显增生肿胀,分泌功能旺盛,炎症细胞趋化到手术部位,同时单核巨噬细胞系统激活,和滑膜细胞一起大量分泌以IL-1为主的炎症介质,IL-1又进一步刺激巨噬细胞、滑膜细胞等效应细胞产生多种细胞因子和炎症介质等,如IL-1、6、8,TNF-α、PGE2、MMP等[12,13],加重关节结构的损伤[14]。

本实验定量动态测定ACL重建术后早期关节滑液中IL-1β的变化,定期测定移植肌腱的生物学力学变化,观察二者关联情况。本组25例膝关节滑液标本中,两组均能检出IL-1β,在ACL重建术后各个时间点实验组IL-1β水平明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.01),表2结果显示ACL重建手术后关节内IL-1β水平逐渐升高,在第2周达到高峰后逐渐下降,但仍然维持在较高水平,第6周时接近正常。手术后2，4，6周重建韧带生物力学检测结果显示实验组韧带强度明显低于正常对照组,两组差异有统计学意义(P<0.01)。生物力学测定结果显示:手术后移植肌腱强度逐渐下降,在第4周时强度达到最低,后逐渐增高。这与Weiler等[4]、Goradia等[5]研究的韧带强度变化结果相一致,组织学上移植物经历了缺血坏死、再血管化,爬行替代、塑形改造等过程,最终完全替代成为在力学和组织学上接近ACL的替代韧带。术后2，4，6周实验组肌腱断裂所需拉力大小分别占正常对照组的23%，12.2%，25.6%。两组韧带最大载荷差异主要是由于实验组属于重建韧带,表面缺乏血供及滑膜包裹,且要经历坏死重建,受关节滑液[16]和以IL-1β为代表的炎症产物影响,抑制延缓重建韧带生物力学强度的恢复。

手术后IL-1β水平在第2周末时含量最高,之后虽然有所下降,但仍然维持在较高水平,关节内大量积聚着以IL-1β为代表的炎症产物,介导炎症细胞聚集,如大量分泌溶酶、胶原酶、蛋白水解酶和各种细胞因子等,重建韧带缺乏血液供应,没有结缔组织和腱周组织包裹覆盖,与炎症产物直接接触,被逐渐消化分解,加上血供破坏远离骨髓道壁处和关节腔内肌腱最先坏死,肌腱组织变细变松脆,坏死部分被巨噬细胞、单核细胞等效应细胞吞噬,所以术后早期韧带强度急剧下降,在第4周末时达到最低点,随着自体血管、成纤维细胞长入韧带内替代逐渐坏死的移植肌腱组织,滑膜组织开始包裹覆盖、塑形修复和关节滑液的吸收、IL-1β水平下降病理生理效应期已过、炎症反应急性期已过等原因,韧带强度逐渐升高。发现手术后移植肌腱生物力学强度与关节滑液中IL-1β水平的变化趋势相反。Henderson等[11]认为,IL-1可以引起滑膜炎症状和软骨破坏,提示ACL重建术后IL-1会破坏关节内结构,对移植肌腱重塑产生不利影响。李康华等[17]研究发现,横断兔前交叉韧带后IL-1β表达增高,可以引起股骨外髁软骨组织退变,提示以IL-1为代表的炎症产物会对韧带、软骨等关节内结构产生负面影响。综上,ACL重建手术后,IL-1β水平变化对移植物生物力学强度产生不利影响,抑制和延缓移植物载荷的恢复。

因此,本研究认为前交叉韧带重建术后关节滑液中IL-1β的水平变化对移植物生物力学强度产生不利影响,提示降低关节内IL-1β水平是改善移植肌腱生物力学强度的积极因素之一。

[1] Dare D, Rodeo S. Mechanisms of post-traumatic osteoarthritis after ACL injury[J]. Curr Rheumatol Rep, 2014, 16(10): 448.

[2] 李泽成,吕松岑.前交叉韧带重建术后髌股关节骨关节炎发病机制[J].实用骨科杂志,2016,22(3):242-245.

[3] Vaishya R, Agarwal AK, Ingole S,etal. Current trends in anterior cruciate ligament reconstruction:a review[J]. Cureus, 2015, 7(11):e378..

[4] Weiler A, Peine R, Pashmineh-Azar A,etal. Tendon healing in a bone tunnel. Part I: Biomechanicalresults after biodegradable interference fit fixation in a model of anterior cruciate ligament reconstruction in sheep[J]. Arthroscopy, 2002, 18(2):113-123.

[5] Goradia VK, Rochat MC, Grana WA,etal. Tendon-to-bone healing of a semitendinosus tendon autograft used for ACL reconstruction in a sheep model[J]. Am J Knee Surg, 2000, 13(3):143-151.

[6] Chun CH, Han HJ, Lee BC,etal. Histologic findings of anterior cruciate ligament reconstruction with Achilles allograft[J]. Clin Orthop Relat Res, 2004, (421):273-276.

[7] van Eck C, Working Z, Fu F. Current concepts in anatomic single-and double-bundle anterior cruciate ligament reconstruction[J]. Phys Sportsmed, 2011, 39(2):140-148.

[8] 王辉,王万明.前交叉韧带重建术后腱骨愈合影响因素研究进展[J].实用医学杂志,2014,30(14):2343-2345.

[9] Pelletier JP, Faure MP, DiBattista JA,etal. Coordinate synthesis of stromelysin, interleukin-1, and oncogene proteins in experimental osteoarthritis. An immunohistochemical study[J]. Am J Pathol, 1993, 142(1):95-105.

[10] 陈游,孙材江,方建珍,等.不同程度膝骨关节炎患者滑液中几种细胞因子水平变化[J].中国临床康复,2002,10(6):1426-1427.

[11] Henderson B, Thompson RC, Hardingham T,etal. Inhibition of interleukin-1-induced synovitis and articular cartilage proteoglycan loss in the rabbit knee by recombinant human interleukin-1 receptor antagonist[J]. Cytokine, 1991, 3(3):246-249.

[12] Zwerina J, Redlich K, Polzer K,etal. TNF-induced structural joint damage is mediated by IL-1[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104(28):11742-11747.

[13] Fernandes JC, Martel-Pelletier J, Pelletier JP. The role of cytokines in osteoarthritis pathophysiology[J]. Biorheology, 2002, 39(1-2):237-246.

[14] Huang JM,Liu HY,Chen FR,etal.Characteristics of bone tunnel changes after anterior cruciate ligament reconstruction using ligament advanced reinforcement system artificial ligament [J].Chin Med J(Engl),2012,125(22):3961-3965.

[15] Cho S, Muneta T, Ito S,etal. Electron microscopic evaluation of two-bundle anatomically reconstructed anterior cruciate ligament graft[J]. J Orthop Sci, 2004, 9(3):296-301.

[16] 董向辉,凌鸣,冯伟楼,等.关节滑液对兔前交叉韧带重建后腱骨愈合生物力学和组织学的影响[J].中国组织工程研究,2012,16(11):1937-1940.

[17] 李康华,周锦颢.前交叉韧带断裂对股骨外髁组织学影响的实验研究[J].中国医师杂志,2009,11(10):1331-1334.

RelationshipbetweenthechangesofbiomechanicsandIL-1βinearlystageafteranteriorcruciateligamentreconstruction

DONG Xianghui, SUN Zhengming, JIN Zhankui, CHANG Yanhai, YANG Bo, LING Ming*

(DepartmentofOrthopedics,People’sHospitalofShaanxiProvince,ThirdAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversityMedicalCollege,Xi’an710068,China;*Correspondingauthor,E-mail:m.ling0114@163.com)

ObjectiveTo establish the model of anterior cruciate ligament reconstruction in rabbits, and explore the relationship between the expression of interleukin 1β in synovial fluid and the biomechanical changes of transplanted tendon in the early stage after operation.MethodsTwenty-five healthy adult New Zealand rabbits were selected, with one side of hind legs as experimental group and the contralateral as normal control group. The anterior cruciate ligament reconstruction model was reconstructed with the ipsilateral hallux longus tendon. All animals were executed at 2, 4, 6 week after surgery.The biomechanical changes of transplanted tendon was determined. The expression level of IL-1β in synovial fluid was detected by ELISA.ResultsELISA results showed that the level of IL-1β in experimental group peaked at 2 week after surgery, and then decreased gradually to the normal level at the end of 6 weeks. At 2, 4 and 6 week after surgery, the tensile force of ligament rupture in experimental group was significantly lower than that in normal control group(P<0.01). The strength of the reconstructed ligament decreased rapidly and reached the lowest at the end of 4 weeks.ConclusionThe level of IL-1β in synovial fluid has an adverse effect on the biomechanical strength of grafts after anterior cruciate ligament reconstruction. The results suggest that the decrease of IL-1β level in the joint is one of the positive factors to improve the biomechanical strength of the transplanted tendon.

interleukin 1β; anterior cruciate ligament reconstruction; hallux longus tendon; biomechanics

R686

A

1007-6611(2017)10-1019-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.10.009

陕西省自然科学基础研究计划项目(2011JM4050)

董向辉,男,1985-08生,硕士,主治医师,E-mail:286314413@qq.com

2017-06-14