补骨脂酚经蛋白激酶Cε拮抗内皮细胞缺血再灌注损伤

王 垒,杜朝升,肖 军,杨 健

(1军委机关事务管理总局北极寺老干局门诊部内科,北京 100191;2中国人民解放军第518医院内科;3中国人民解放军第309医院心血管内科;4中国人民解放军第313医院心血管内科;*通讯作者,E-mail:yangjian31313@126.com,#共同通讯作者,E-mail:xxxjjj6288@sina.com)

补骨脂酚经蛋白激酶Cε拮抗内皮细胞缺血再灌注损伤

王 垒1,杜朝升2,肖 军3#,杨 健4*

(1军委机关事务管理总局北极寺老干局门诊部内科,北京 100191;2中国人民解放军第518医院内科;3中国人民解放军第309医院心血管内科;4中国人民解放军第313医院心血管内科;*通讯作者,E-mail:yangjian31313@126.com,#共同通讯作者,E-mail:xxxjjj6288@sina.com)

目的 研究补骨脂酚(BAK)对血管内皮细胞模拟缺血再灌注损伤(SIR)的保护作用及其分子机制。 方法 用不同浓度BAK(2,5,10 μmol/L)预处理体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)24 h,接受模拟缺血再灌注(SIR)损伤(缺血45 min,再灌注4 h),用CCK-8法和TUNEL法分别检测细胞活力和凋亡率,酶活性测定法检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性,细胞中丙二醛(MDA)的含量及超氧化物歧化酶(SOD)的活性,DHE荧光探针检测细胞中活性氧(ROS)的含量,Western blot法检测细胞膜PKCε、细胞质PKCε、Bcl-2、Bax、cleaved caspase 3和gp91phox蛋白的表达水平。使用PKCε特异性阻断剂εV1-2阻断该信号通路,进一步探究PKCε信号通路在其中的作用。 结果 BAK预处理呈剂量依赖性地改善内皮细胞SIR损伤,且10 μmol/L剂量效果最佳。BAK预处理可明显提高缺血再灌注损伤后内皮细胞活力,减少LDH释放,增强细胞中SOD活性,降低MDA含量及gp91phox蛋白表达量,减少ROS的产生;促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,抑制凋亡蛋白cleaved caspase 3,Bax的表达,降低再灌注损伤后细胞凋亡率;并且显著促进PKCε膜转位,而特异性阻断PKCε信号通路可逆转BAK的上述保护作用(均P<0.05)。 结论 BAK通过激活PKCε信号通路,进而增强细胞抗氧化应激和抗凋亡能力,最终缓解内皮细胞缺血再灌注损伤。

补骨脂酚; 人脐静脉内皮细胞; 缺血再灌注损伤; 蛋白激酶C epsilon; 氧化应激; 凋亡

缺血性心脏病严重危害当今社会人类生命健康,其首要治疗策略是及时恢复缺血心肌的血流灌注,然而血流再灌注易加重心肌组织结构损伤及能量代谢障碍,诱发心肌缺血再灌注损伤[1, 2]。这种损伤可导致血流障碍、心功能异常、炎症反应、内皮细胞损伤、心肌细胞坏死和凋亡等[3, 4]。

血管内皮细胞介于血液与组织间,发挥着屏障作用,同时具有多种生理功能,对维持内环境的稳定起着积极作用。在体、离体器官缺血再灌损伤模型以及缺氧处理分离培养的内皮细胞研究均表明:内皮细胞是缺血再灌注损伤的重要靶器官,缺血再灌注可引起内皮细胞代谢、功能的改变,进而引起内皮细胞损伤甚至死亡[5]。

补骨脂酚(bakuchiol,BAK)是从豆科植物补骨脂种子中提取的、含有酚基的单萜化合物[6],对皮肤和肝脏具有一定的保护作用[7-9]。国内外研究发现BAK具有抗氧化应激[10, 11]、抗炎[12]、抗衰老[9,10]、降糖降血脂[13]等药理学作用。氧化应激和炎症反应在缺血再灌注损伤中扮演重要角色[14-16],这表明BAK在减轻缺血再灌注损伤中可能发挥重要作用。同时,也有研究证实蛋白激酶Cε(protein kinase C epsilon,PKCε)是内皮细胞自我保护性通路的重要上游调节分子,发挥着重要的抗炎、抗氧化应激和凋亡的作用[17],然而其是否介导BAK抗内皮细胞缺血再灌注损伤尚未见报道。为此,本研究采用模拟缺血液建立内皮细胞缺血再灌注损伤模型(simulated ischemia reperfusion,SIR),观察BAK对内皮细胞缺血再灌注损伤的保护作用,并初步探讨PKCε信号通路在其中的作用,为将其开发为缺血性心肌病及其并发症的治疗药物提供理论和实验基础。

1 材料和方法

1.1 细胞株及主要试剂

人脐静脉内皮细胞(ScienCell公司,美国);补骨脂酚(BAK),DAPI染液和超氧化物阴离子荧光探针(DHE)(Sigma-Aldrich公司,美国);质膜分离试剂盒(Thermo scientific公司,美国);原位缺口末端标记法(TUNEL)检测试剂盒(Roche公司,美国);乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);CCK8细胞毒性检测试剂盒(上海七海复泰生物科技有限公司);anti-PKCε和anti-gp91phox抗体(Santa Cruz公司,美国);anti-Bcl-2、anti-Bax、anti-cleaved caspase 3抗体(Cell Signaling公司,美国);anti-β-actin抗体(CMCTAG公司,美国);辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、羊抗鼠IgG二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 主要实验仪器

灭菌型CO2细胞培养箱(Thermo,HEPA class 100);激光扫描共聚焦显微镜(Olympus,FV10C-W3)、倒置显微镜(Olympus,TH4-200);高速低温离心机(Eppendorf,Centrifuge 5424 R);Western blot电泳、转膜(Bio-Rad,#1658034)及凝胶成像设备(Bio-Rad,1708265);酶标仪(SpectraMax,M5)。

1.3 HUVECs的培养及缺血再灌注模型的建立

HUVECs的培养用含10%胎牛血清的完全培养液在37 ℃,5%CO2培养箱内培养;缺血再灌注损伤通过模拟缺血液实现。待将细胞接种于培养板或培养瓶后,弃掉培养液,加入缺血液(含CaCl2·2H2O 0.9 mmol/L、MgCl20.49 mmol/L、NaCl 137 mmol/L、KCl 12 mmol/L、HEPES 4 mmol/L、脱氧葡萄糖 10 mmol/L、连二亚硫酸钠 0.75 mmol/L、乳酸钠 20 mmol/L,pH值调至6.5)避光置于37 ℃,5% CO2的培养箱内培养45 min,模拟缺血结束后更换正常DMEM在培养箱中继续孵育4 h完成再灌注。

1.4 CCK-8法检测各组HUVECs活力

①为观察BAK不同药物浓度对内皮细胞缺血再灌注损伤后的作用，将实验分为5组：Con组；SIR组；BAK 2 μmol/L+SIR组；BAK 5 μmol/L+SIR组；BAK 10 μmol/L+SIR组，在SIR损伤前，BAK药物预处理时间为24 h。②为观察PKCε信号通路是否介导BAK抗内皮细胞SIR损伤的作用，在BAK处理前用PKCε特异性阻断剂εV1-2预处理1 h以阻断PKCε通路，实验分组如下：SIR组；BAK+SIR组；εV1-2+BAK+SIR组；εV1-2+SIR组，观察εV1-2对BAK抗内皮细胞SIR损伤的影响，εV1-2浓度为10 μmol/L(已证实该浓度本身对SIR后细胞活力无明显影响)。将内皮细胞接种于96孔板上，每组8个复孔，各组细胞处理结束后，吸净培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，再加入100 μl无血清培养液和10 μl CCK-8检测液，避光置于培养箱继续孵育2 h，用酶标仪检测各孔OD值(450 nm波长下吸光度值)。

1.5 DHE荧光探针检测ROS含量

将HUVECs接种于共聚焦皿和96孔板上,各组细胞处理结束后,吸净培养液,用PBS清洗3次,用含有5 μmol/L的DHE的无血清培养液和细胞一起避光在培养箱孵育30 min,进行荧光探针装载,随后用无血清的培养液洗涤细胞3次,用酶标仪检测各孔OD值(535 nm波长下吸光度值)并用激光扫描共聚焦显微镜照相。

1.6 细胞凋亡的TUNEL法检测

各组细胞处理结束后,吸净培养液,用PBS小心洗涤3次。4%多聚甲醛4 ℃固定30 min,PBS漂洗3次。用0.1%的Triton X-100打孔10 min,再用PBS洗涤3遍。按照TUNEL检测试剂盒说明书将1号和2号液混合配制,避光滴加在细胞上,37 ℃孵育2 h,PBS振荡洗涤3遍。DAPI液染细胞核避光37 ℃孵育10 min，PBS振荡洗涤3次。激光扫描共聚焦显微镜照相。以凋亡细胞数(绿色荧光)占总细胞数(蓝色荧光)的百分比(%)表示细胞凋亡率(apoptotic index)。

1.7 LDH、SOD活性及MDA含量检测

各组处理结束后,分别收集培养液和内皮细胞,按照LDH试剂盒方法测定培养液中LDH 活性。用PBS作为匀浆介质破碎细胞后离心取上清,按照试剂盒说明书检测细胞中SOD活性及MDA含量。

1.8 Western blot检测细胞PKCε通路及相关蛋白表达水平

细胞总蛋白的提取:各组细胞处理结束后,用PBS清洗并置于冰上,加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制剂混合物,充分震荡混匀,冰上裂解20 min并收集,随后以12 000 r/min离心20 min。细胞裂解上清用BCA法测定蛋白浓度进行蛋白定量。

细胞膜、细胞质蛋白的提取:参照Thermo公司质膜分离试剂盒的方法进行,分别提取HUVECs细胞质和细胞膜蛋白,用BCA方法测定蛋白浓度进行蛋白定量。各组蛋白经聚丙烯酰胺变性凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,并用湿转法转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜),5%脱脂牛奶室温封闭2 h,分别孵育在PKCε(1 ∶500)、gp91phox(1 ∶500)、Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)、cleaved caspase 3(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶4 000)抗体中4 ℃过夜。TBST洗脱3次,加入对应辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、羊抗鼠IgG二抗,室温孵育2 h,TBST洗脱3次,通过Bio-Rad照相系统采集照片,用ImageLab软件对其进行分析,以β-actin作为内参,分别检测gp91phox、Bcl-2、Bax和cleaved caspase 3蛋白表达情况,以胞膜PKCε与胞质PKCε蛋白表达量之比来表示PKCε的膜转位情况。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 补骨脂酚可减轻缺血再灌注后内皮细胞损伤及氧化应激水平

与Con组相比,SIR处理后HUVECs的存活率显著降低, LDH的释放量显著增多,同时HUVECs损伤后贴壁能力明显下降,脱落增加;并且SIR处理显著降低了SOD活性,增加了MDA的含量(P<0.05);不同浓度的BAK预处理均可提高SIR损伤后HUVECs的存活率和贴壁能力,减少LDH的释放及HUVECs的脱落,提高SOD活性,且MDA含量也显著降低,其中BAK浓度为10 μmol/L作用效果最明显(P<0.05,见图1)。

2.2 补骨脂酚可增强缺血再灌注后内皮细胞PKCε的膜转位水平并抑制其凋亡

与Con组相比,SIR处理显著降低了HUVECs的PKCε膜转位水平和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,而凋亡蛋白cleaved caspase 3和Bax表达量明显增加(P<0.05);不同浓度的BAK预处理均可提高SIR损伤后HUVECs的PKCε膜转位水平和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,并抑制凋亡蛋白cleaved caspase 3和Bax的表达,其中BAK浓度为10 μmol/L时作用效果最明显(P<0.05,见图2),后续实验均采取此浓度进行药物预处理。

2.3 补骨脂酚预处理通过PKCε信号通路减轻缺血再灌注后内皮细胞损伤及氧化应激水平

阻断PKCε信号通路后发现,与BAK+SIR组相比,εV1-2+BAK+SIR组细胞存活率显著下降,LDH释放量明显增加(P<0.05);并且细胞中SOD活力显著下降,MDA含量、ROS生成量及氧化应激标志蛋白gp91phox表达量均显著增加(P<0.05)。与SIR组相比,εV1-2+SIR组HUVECs细胞存活率、LDH释放量、细胞中MDA含量、SOD、ROS生成量及gp91phox表达量均没有显著变化(P>0.05,见图3)。

图1 BAK对SIR损伤后内皮细胞活力、LDH活性及氧化应激水平的影响Figure 1 The effects of BAK treatment on the cell viability, LDH activity and oxidative stress level following SIR injury in HUVECs

与Con组相比,*P<0.05;与SIR组相比,#P<0.05;与BAK 10 μmol/L+SIR组相比,△P<0.05；1. Con组； 2. SIR组； 3. BAK 2 μmol/L+SIR组； 4. BAK 5 μmol/L+SIR组； 5. BAK 10 μmol/L+SIR组图2 BAK对SIR损伤后内皮细胞凋亡相关蛋白表达及PKCε膜转位的影响Figure 2 The effects of BAK treatment on the apoptosis-related protein expression and PKCε translocation following SIR injury in HUVECs

2.4 补骨脂酚预处理通过PKCε信号通路减轻缺血再灌注后内皮细胞凋亡水平

阻断PKCε信号通路后发现,与BAK+SIR组相比,εV1-2+BAK+SIR组细胞的PKCε膜转位水平明显降低(P<0.05);同时细胞凋亡率明显增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降,凋亡蛋白Bax、cleaved caspase 3表达增加(P<0.05)。与SIR组相比,εV1-2+SIR组Bcl-2、Bax、cleaved caspase 3蛋白表达和细胞凋亡率无显著变化(P> 0.05,见图4，5)。

1. SIR组；2. BAK+SIR组；3. εV1-2+BAK+SIR组；4. εV1-2+SIR组与SIR组相比,#P<0.05;与BAK+SIR组相比,*P<0.05;与εV1-2+BAK+SIR组相比,△P<0.05图3 BAK与εV1-2处理对SIR损伤后内皮细胞活力、LDH活性及氧化应激水平的影响Figure 3 The effects of combination of BAK and εV1-2 on the cell viability, LDH activity and oxidative stress level following SIR injury in HUVECs

图4 细胞凋亡的TUNEL染色荧光图Figure 4 TUNEL staining of cell apoptosis after different treatment

1. SIR组； 2. BAK+SIR组； 3. εV1-2+BAK+SIR组； 4. εV1-2+SIR组与SIR组相比,#P<0.05;与BAK+SIR组相比,*P<0.05;与εV1-2+BAK+SIR组相比,△P<0.05图5 BAK与εV1-2处理对SIR损伤后内皮细胞凋亡率、凋亡相关蛋白表达及PKCε膜转位的影响Figure 5 The effects of BAK and εV1-2 combination treatment on the apoptotic index, apoptosis-related protein expression and PKCε translocation following SIR injury in HUVECs

3 讨论

缺血再灌注会引起氧化应激损伤及细胞凋亡,是心脏外科手术和缺血性心肌病预后较差的主要原因之一[18]。线粒体在缺血再灌注损伤中扮演重要角色,再灌注之后的钙超载及氧化应激水平的上升均会损伤线粒体内膜及其电子传递链,进而导致线粒体结构及功能损伤,最终影响细胞能量代谢。因此,减轻线粒体氧化应激损伤并维持其功能是防治心肌缺血再灌注损伤的重要途径[19]。

BAK具有多种生理学和药理学作用,对多种疾病都具有治疗和预防作用。有研究表明,BAK可减轻四氯化碳等肝脏毒物引起的肝细胞损伤[8],也可通过Caspase 3凋亡通路减轻肝脏纤维化及肝硬化等[7]。在脂多糖诱导的肺损伤等炎症反应中,BAK也作为一种有效的抗炎介质发挥重要作用[20]。同时,有研究证实,BAK可抑制活性氧物质的产生并保护线粒体功能[10]。近期一项心肌缺血再灌损伤实验也报道,BAK可通过SIRT1信号通路,发挥抗氧化应激、抗心肌细胞凋亡等保护作用[18],然而其能否减轻内皮细胞氧化应激损伤尚不明确。在本研究中我们观察到BAK预处理24 h能明显提高SIR损伤后内皮细胞存活率,降低内皮细胞LDH的释放,增强细胞SOD活性,并降低细胞MDA含量及cleaved caspase 3的表达,且这种保护作用表现为剂量依赖性。

蛋白激酶C是一种多功能丝氨酸和苏氨酸激酶,发挥调控细胞增殖、分化和凋亡等多种生物学功能,依据其结构和激活方式将其分为三种亚型(A型:α、βⅠ、βⅡ和γ;B型:δ、ε、η/L和θ;C型:ζ和λ)。PKCε与多种疾病密切相关,其广泛分布于多种组织、器官和细胞中,静止细胞中的PKCε主要存在于胞质,当细胞受到刺激后,PKCε以甘油二酯(DAG)依赖的形式从胞浆移位到细胞膜上,此过程称之为转位。一般将PKCε的转位作为PKCε激活的标志。前期研究表明,PKCε具有促进细胞生存效应,并且在心肌细胞缺血预处理中发挥抑制细胞凋亡作用[21, 22]。PKCε能调控内皮细胞保护性基因A1、A20 和 Bcl-2的组成性表达[17]。有研究报道,PKCε具有很强的抗氧化特性,激活PKCε可以减轻内皮细胞氧化应激损伤[23]。本研究同样观察到,在内皮细胞缺血再灌注损伤模型中,经BAK预处理可剂量依赖性促进PKCε膜转位,进而激活PKCε信号通路。同时BAK预处理可明显减少ROS生成量,上调Bcl-2/Bax比例,降低cleaved caspase 3、gp91phox的表达量及细胞凋亡率,发挥抑制细胞凋亡与减轻线粒体氧化应激损伤的作用。并且阻断PKCε信号通路可抵消BAK的上述保护效应,进一步肯定了PKCε信号通路介导BAK对HUVECs的保护作用。

综上所述,本研究证实BAK可以减轻内皮细胞缺血再灌注损伤,其机制为激活PKCε保护性信号通路,减轻氧化应激损伤,抑制内皮细胞的凋亡。

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BakuchiolprotectsvascularendothelialcellsagainstischemiareperfusioninjuryviaPKCεsignalingpathway

WANG Lei1, DU Chaosheng2, XIAO Jun3#, YANG Jian4*

(1DepartmentofMedicine,Out-patientDepartmentofBeijisi,AgencyforOfficesAdministrationofCentralMilitaryCommission,Beijing100191,China;2DepartmentofMedicine, 518thHospitalofChinesePeople’sLiberationArmy;3DepartmentofCardiovascularDiseases, 309thHospitalofChinesePeople’sLiberationArmy;4DepartmentofCardiovascularDiseases, 313thHospitalofChinesePeople’sLiberationArmy;*Correspondingauthor,E-mail:yangjian31313@126.com;#Co-correspondingauthor,E-mail:xxxjjj6288@sina.com)

ObjectiveTo explore the protective effects of bakuchiol(BAK) against simulated ischemia reperfusion(SIR)-induced injury in human umbilical vein endothelial cells(HUVECs) and its underlying mechanisms.MethodsThe cultured HUVECs were pretreated with BAK(2, 5, 10 μmol/L) for 24 h and then subjected to SIR (45 min ischemia, 4 h reperfusion). Cell viability and apoptotic index were detected by CCK-8 and TUNEL methods, and the lactate dehydrogenase(LDH) releasing, intracellular malondialdehyde(MDA) content, superoxide dismutase(SOD) were all assessed by specialized kits. The translocation of protein kinase C epsilon(PKCε) and the expression levels of Bcl-2, Bax, cleaved caspase 3 and oxidative stress marker gp91phoxwere detected by Western blot. Dihydroethidium(DHE), a fluorescence probe, was used to detect the presence of reactive oxygen species(ROS). The εV1-2, a specific inhibitor of PKCε signaling, was used to further study the role of PKCε in this process.ResultsBAK pretreatment protected HUVECs against SIR injury in a dose-dependent manner, especially at the concentration of 10 μmol/L.BAK pretreatment significantly improved the cell viability, reduced LDH releasing, up-regulated the SOD activity and down-regulated the MDA content of SIR-treated HUVECs (P<0.05). In addition, BAK supplementation significantly reduced the apoptotic index, increased PKCε translocation and Bcl-2 expression, and decreased the expression levels of cleaved caspase 3, Bax and gp91phox(P<0.05). However, the protective effects of BAK mentioned above were significantly attenuated by εV1-2(P<0.05).ConclusionBAK pretreatment can protect against SIR-induced oxidative stress and apoptosis on HUVECs via PKCε signaling pathway.

bakuchiol; human umbilical vein endothelial cells; ischemia reperfusion injury; protein kinase C epsilon; oxidative stress; apoptosis

R363

A

1007-6611(2017)10-0975-07

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.10.001

北京市自然科学基金资助项目(7122178);总参军事医学和老年病科研基金资助项目(ZCWS14C12)

王垒,男,1981-05生,硕士,主治医师,E-mail:360096485@qq.com

2017-06-12