红花多糖对人非小细胞肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

董娅 赵钰玲 范亚莉 杨栓盈 鱼军 王娟红 王琦侠 李建英

红花多糖对人非小细胞肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

董娅1，2赵钰玲1，2范亚莉1，2杨栓盈3鱼军4王娟红5王琦侠6李建英1

目的探讨不同浓度的红花多糖(safflower polysaccharide,SPS)对人非小细胞肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响。方法根据台盼蓝染色法绘制细胞生长曲线及计算细胞活力；用不同浓度(0.04,0.08,0.16,0.32,0.64,1.28,2.56mg/mL)的红花多糖处理A549细胞24、48、72h后在倒置显微镜下观察细胞形态学改变；四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度(0.04,0.08,0.16,0.32,0.64,1.28,2.56mg/mL)的红花多糖对人非小细胞肺癌细胞体外生长的抑制作用，AnnexinV-FITC/PI荧光双标流式细胞术检测细胞凋亡率。结果台盼蓝染色后发现在第2-6天细胞呈对数生长，在第3-5天细胞活力最好；不同浓度SPS处理24,48,72h后，各时间点均以0.64mg/mL的SPS抑制率最高；不同浓度SPS处理48h后，倒置显微镜下A549细胞表现为皱缩、变圆等细胞凋亡性；各浓度组A549细胞的凋亡率增加呈剂量依赖性，而1.28mg/mL组除外。结论红花多糖能明显抑制人非小细胞肺癌A549细胞的增殖，诱导A549细胞的凋亡，在SPS浓度为0.64mg/mL最为显著。

A549细胞；红花多糖；增殖；凋亡

红花是活血化瘀药的代表药，药理作用广泛，《中药药理学》明确指出红花具有抗肿瘤作用[1]，现代药理学研究表明[2-3]，红花还具有抗氧化、抗凝血、降血压以及免疫调节等多种药理活性。红花多糖(safflower polysaccharide,SPS)是从红花中提取的有效活性成分，近年来关于多糖抗肿瘤的研究逐渐增多,多糖通过抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡及抑制细胞周期等。有研究发现，SPS具有抗肿瘤及增强机体免疫功能[4-5]、保护大鼠脑缺血再灌注损伤[6]；明显增强H22荷瘤小鼠的免疫功能，清除自由基、减轻活性氧造成的损伤[7]。前期研究证实，红花多糖可通过调节细胞调亡及细胞周期，实现对胃癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌[8-12]等恶性肿瘤细胞的体外抑制作用，但其对非小细胞肺癌细胞的作用及其机制尚未明确,本文旨在研究SPS对人非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡的影响，以期为肺癌的治疗寻找新的治疗方法及理论基础。

资料与方法

一、实验材料

1 细胞株：人非小细胞肺癌A549细胞株由第四军医大学生化实验室提供。

2 主要仪器：Multiskan Mk3酶标仪(Thermo公司)，流式细胞仪(BD FACSCalibur)。

3 主要试剂：台盼蓝(TRYPAN BLUE),MP Biomedical.LLC公司,批号MR29186；四甲基偶氮唑蓝(MTT) Sigma公司，批号:M2128；RPMI-1640培养基,Hyclone公司，批号：ABA211779；胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司 批号150130)；0.25%胰蛋白酶消化液,Solabio公司，批号：20160421；二甲基亚砜(DMSO) Sigma公司批号：D5879；Annexin V-FITV 细胞凋亡检测试剂盒，Miltenyi Biotec GmbH,货号：5160412036。

4 药品：红花多糖(上海瑞康生物 批号20160504 纯度90%)。

二、实验方法

1 细胞培养及传代：将人非小细胞肺癌A549细胞接种于培养瓶中，放入37℃、5%CO2培养箱中培养，每隔12-24小时在倒置显微镜下观察细胞的生长状态，取对数生长期的细胞进行实验。

2 不同浓度的红花多糖对非小细胞肺癌A549细胞形态的影响：取对数生长期的非小细胞肺癌A549细胞，分别加入200 uL 0.04 mg/mL、0.08 mg/mL、0.16 mg/mL、0.32 mg/mL、0.64 mg/mL、1.28mg/mL、2.56 mg/mL 七个浓度的红花多糖，在24h、48h、72h在倒置显微镜下观察细胞的形态学变化，并拍照。

3 人非小细胞肺癌A549细胞生长曲线的测定：取对数生长期的人非小细胞肺癌A549细胞，制成浓度为104个/mL 的单细胞悬液，培养24 h 后，任取3孔用台盼蓝染色法进行活细胞细胞计数，总共持续计数9d，且重复独立实验3次，按照平均值绘制生长曲线。

4 人非小细胞肺癌A549细胞生长活力的测定：取对数生长期的非小细胞肺癌A549细胞，制成浓度为104个/mL 的单细胞悬液，培养24 h 后，任取3孔计数，并用台盼蓝染色法单独进行活细胞细胞计数，总共持续计数9d，且重复独立实验3次，按照下面公式计算细胞活力。

细胞活力=(细胞总数—死细胞数)/细胞总数×100%

5 MTT法检测：取对数生长期的非小细胞肺癌A549细胞，以5×104个/孔的浓度接种于无菌的96孔培养板，按照MTT法常规进行，在酶联免疫检测仪490 nm处检测各孔吸光度值(OD)。按照下面公式计算细胞生长抑制率(inhibition rate,IR%)：生长抑制率(IR%)=[1-实验组平均OD值/空白最照组OD值]×100%

6 SPS对A549细胞凋亡的影响：将对数生长期的人肺癌细胞A549用0.25%胰蛋白酶进行消化后，以2×105个/孔的浓度接种到无菌的6孔细胞培养板，按照Annexin V-FITV 细胞凋亡检测试剂盒步骤处理标本后放入流式细胞仪中进行检测，将激发波长Ex设置为488nm，发射波长Em设置为530nm 并计算细胞凋亡率。

三、 统计学分析

结 果

一、 SPS对A549细胞形态的影响 对照组A549细胞贴壁良好，呈梭形贴壁生长，不同浓度的SPS处理48h后，细胞的形态发生了明显变化，表现为细胞整体萎缩、变圆、细胞折光减弱等典型细胞凋亡性状, 在SPS浓度 0.64mg/mL时最显著(见图1)

二、 A549细胞生长曲线的测定(见图2)

三、 A549细胞细胞活力的测定(见图3)

四、 SPS对A549细胞增殖的影响

SPS作用后人非小细胞肺癌A549细胞生长明显受抑制，呈现一定程度的时间、浓度依耐性，表现为随着浓度的增高，作用时间的延长，抑制率增高，各时间点均以0.64mg/mL的SPS抑制率最高，剂量升高至1.28mg/mL的时抑制率反而下降(见表1)。

五、各浓度SPS作用48h对A549细胞凋亡的影响

双变量流式细胞仪的散点图(见图4)左下象限为正常活细胞( AnnexinV- /PI-)；右下象限为早期凋亡细胞( AnnexinV+ /PI-)；右上象限为晚期凋亡或坏死细胞( AnnexinV+ /PI+ )；而左上象限为细胞膜破损细胞( AnnexinV-/PI+)[13]。

图1 不同浓度的SPS作用48h对A549细胞形态的影响(倒置显微镜×100)

注：A:对照组SPS浓度0mg/mL；B: SPS浓度0.04mg/mL； C: SPS浓度0.08mg/mL；D:SPS浓度 0.16mg/mL；E:SPS浓度0.32mg/mL； F:SPS浓度0.64mg/mL； G：SPS浓度1.28mg/mL； H：SPS浓度2.56mg/mL

图2 0-192h A549细胞的生长曲线图

图3 第1-8天A549细胞活力图

表1 不同浓度的SPS对A549细胞增殖的影响

*P<0.05

SPS作用A549细胞48h后各组细胞的凋亡率增高，以0.64mg/mL凋亡率最高。(见图4)。

讨 论

肺癌是严重威胁人类生命健康的常见恶性肿瘤之一，近年来，其病死率和发病率呈逐年递增趋势,非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是一种上皮组织来源的恶性肿瘤，占肺癌的80%，5年生存率不到15%[14], 传统的治疗方法如手术、放疗及化疗等不良反应大，疗效欠佳，这与NSCLC的发病机制不明、缺乏有效的治疗手段密切相关，因此,研究其发生、发展的分子机制，并从中寻找有效的治疗手段已成为NSCLC研究领域迫切需要解决的问题。目前，越来越多的中草药及其提取物应用于NSCLC的治疗，多种中草药对病灶稳定性、生存期和生活质量有显著改善，并有抗复发转移潜在优势。有研究发现，SPS可抑制肺癌细胞的生长及转移，增强T淋巴细胞的增殖能力，在肿瘤免疫中发挥着重要作用[15]，它的抗肿瘤作用机制可能与增强CTL、NK细胞的毒活性有关[4]。但SPS作用于NSCLC细胞的靶途径、靶位点、靶分子及信号转导机制等仍不明确，因此需要进行进一步的深入研究。

图4 SPS作用A549细胞48h的凋亡率

注： A:对照组SPS浓度0mg/mL B: SPS浓度0.08mg/mL C :SPS浓度0.16mg/mL; D: SPS浓度 0.32mg/mL； E:SPS浓度0.64mg/mL；F:SPS浓度1.28mg/mL

本实验主要观察不同浓度SPS对人NSCLC A549细胞增殖与凋亡的影响，初步探讨SPS对人NSCLC细胞的抑制机制，为防治提供可能的治疗策略。

本研究首先从形态学上观察SPS可能诱导人NSCLC A549细胞凋亡，在倒置显微镜下观察不同浓度的SPS作用后A549细胞贴壁细胞减少，细胞间隙增大，且部分细胞变圆，体积缩小，部分细胞悬浮在培养基中，在0.64mg/mL SPS作用48h后最为显著；再通过台盼蓝染色，细胞计数法绘制细胞的生长曲线及计算细胞活力，发现在第2-6天细胞呈对数生长，在第3-5天细胞活力最好；在MTT抑制试验中，不同浓度SPS作用后人NSCLC A549细胞生长明显受抑制，呈现一定程度的时间、浓度依耐性，表现为随着浓度的增高，作用时间的延长，抑制率增高，各时间点均以0.64mg/mL的SPS抑制率最高；最后通过流式细胞仪检测细胞凋亡，发现SPS作用A549细胞48h后各组细胞的凋亡率增高，以0.64mg/mL凋亡率最高。

综上所述，SPS能明显抑制人NSCLC A549细胞的增殖，并可诱导A549细胞的凋亡，在SPS浓度为0.64mg/mL最为显著，但SPS对人NSCLC细胞的更深层次作用机制还需要进一步研究，为临床应用提供可靠的论据。

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Effectofsafflowerpolysaccharideonproliferationandapoptosisinhumannon-smallcelllungcancercelllineA549

DONGYa,ZHAOYu-ling,FANYa-li,YANGShuan-ying,YUJun,WANGJuan-hong,WANGQi-xia,LIJian-ying

DepartmentofRespiratoryDisease,Xi’anCentralHospitalAffiliatedtoMedicalcollegeofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an,Shaanxi710003,China

ObjectiveTo investigate the potential anti-apoptotic effect of safflower polysaccharide on A549 cells of human non-small cell lung cancer.MethodsTrypan blue staining was used to count the alive cells in order to draw a cellular growth curve and calculate cell viability. A549 cells were treated with different concentrations (0.04, 0.08, 0.16, 0.32, 0.64, 1.28 and 2.56 mg/mL) of SPS for 24, 48 and 72 hours. Inverted Micro-scope was used to observe the morphological changes of A549 cells. Different doses of safflower polysaccharide (0.04, 0.08, 0.16, 0.32, 0.64, 1.28 and 2.56 mg/mL) were added to A549 cells. The MTT assay was performed to reveal the inhibitory effect on cell proliferation. Flow cytometry using annexin V-FITC/PI staining was employed to measure cell apoptosis.ResultsThe Trypan blue staining showed the 2nd to 6th days was logarithmic growth phase and cell viability was the best from the 3rd to 5th days. After being treated by SPS for 24, 48 and 72 hours, the highest inhibition rate was 0.64mg/mL. After being treated by SPS for 48h, evident morphological changes including membrane shrinking, rounding shaping and budding to form apoptotic characters were observed. SPS treatment inhibited the proliferation in a dose-dependent manner and the rate of cell apoptosis was increased also in a dose-dependent manner except 1.28mg/mL.ConclusionSPS could inhibit the proliferation of A549 and enhance apoptosis of A549 especially in 0.64mg/mL.

A549 cells; safflower polysaccharide; proliferation; apoptosis

2017-03-20]

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.11.030

陕西省自然科学基金(No 2012JC2-06) 陕西省科技攻关项目(No 2014k11-01-02-15)

710003 陕西 西安,西安交通大学医学院附属西安市中心医院 1.呼吸内科、4.普外科、5.病理科、6.血液病研究所 2. 716000 陕西 延安,延安大学医学院 3. 710003 陕西 西安,西安交通大学附属第二医院呼吸内科