低级别胚胎囊胚培养及临床结局分析

郑州大学附属洛阳中心医院（471003）戚静宜 牛吉峰

在体外受精－胚胎移植（IVF/ICSIET）技术中，冷冻前进行囊胚培养可以使胚胎细胞数增多，以便可以选取最为优质的胚胎进行冷冻[1]。其中部分低级别的胚胎（Ⅲ级、Ⅳ级）在受精后第三天仍有继续发育为优质囊胚的潜质，且移植后具有临床妊娠价值，使胚胎利用率增加[2]。因此，低等级胚胎囊胚继续培养及移植，提高临床妊娠率，已成为社会广泛关注的问题。笔者就低等级的胚胎进行继续培养，部分胚胎也可发展为优质囊胚，进行移植后可提高临床妊娠率及胚胎利用率。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年6月～2016年6月收集到的行体外受精－胚胎移植技术治疗的123个治疗周期，将受精后3天（D3）进行移植、冷冻的436枚低级别胚胎继续培养2～3天，所有患者在年龄、内膜准备等方面无明显差异性（P>0.05），避免移植后因个人因素而影响临床妊娠率及胚胎利用率。

1.2 方法

1.2.1 精液处理 精液取出并液化后采用离心法收集精液，当精子浓度为1.5×106/ml时，进行授精。卵胞浆内单精子注射(ICSI)患者，卵母细胞采用透明质酸酶（Spectrum，美国，CAS编号：37326-33-3，生产批号20140312）将颗粒细胞去除，然后放置在4孔皿中，卵子取出后4～6小时，选取MⅡ期的卵子，进行显微镜下受精、注射，通过评分的方式，评价原核期胚胎、第2、3天（D2、D3）胚胎的发育情况。将发育优质的胚胎在受精后的第3天进行冷冻、移植，将低等级的胚胎胚囊进行继续培养，观察囊胚的情况。胚胎培养的液体均放置于二氧化碳培养箱QP-80（济南安畅医疗设备有限公司，生产批号20140521）中。

1.2.2 胚胎移植 解冻的卵裂胚或囊胚转移到胚胎移植管（COOK，美国，K-JSPPE-681710，生产批号20140113）中，在B超监视下移植入子宫。

1.2.3 胚胎评分 卵裂期胚胎分级：依据Peter卵裂期胚胎评分系统评估受精后第3天胚胎质量，卵裂球大小基本均匀，碎片在5%以下者为Ⅰ级；卵裂球碎片在20%以下者为Ⅱ级；卵裂球碎片中无核碎片占21%～50%者为Ⅲ级；卵裂球碎片中无核碎片占50%以上者为Ⅳ级。低级别胚胎为4、5及>9个卵裂球Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级，6～10个卵裂球Ⅲ级、Ⅳ级[3]。

胚囊分级：依据Garnder囊胚分级法评价囊胚，首先需根据囊胚的扩张及孵出程度分级囊胚：早期囊胚，囊胚腔体积不到总体积的1/2为1级；囊胚腔体积超过总体积的1/2为2级；囊胚腔占据整个囊胚为3级；囊胚腔体积明显大于早期囊胚为4级；囊胚正在孵化为5级；囊胚腔孵化并从透明带中脱出为6级[4]。还需对3～6级的囊胚进行内细胞团评分和滋养外胚层细胞评分：内细胞团评分（ICM评分）：A级为结合紧密，细胞多；B级为结合松散，细胞较少；C级为细胞极少；滋养外胚层细胞评分（TE评分）：A级为细胞多，胚囊周围有细胞分布；B级为细胞较少，上皮细胞松散；C级为细胞数目极少。优质胚囊为受精后第5天评分在3AA、3AB、3BA、3BB以上或者受精后第6～7天评分在4AA、4AB、4BA、4BB以上[5]。

1.2.4 囊胚冷冻保存及解冻 囊胚冷冻保存及解冻方法需按照冷冻液、解冻液（Origio，丹麦，生产批号20140521）的操作说明进行操作。胚胎移植当天就进行解冻时，需进行4小时的培养，依据胚胎评分移植。

1.3 观察指标 临床妊娠的判定：胚胎移植后14天进行血绒毛膜促性腺激素（hCG）检查，移植后的35天进行超声检查，检查结果中如可见妊娠囊及心血管波动，则可判定为临床妊娠。

1.4 统计学分析 应用统计学软件SSPS18.0，以X2检验计数资料（%）。P＜0.05提示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 低等级胚胎囊胚继续培养形成囊胚结果 在行体外受精－胚胎移植技术的123个治疗周期中，将受精后3天（D3）进行移植、冷冻的436枚低级别胚胎继续培养2～3天，有143枚形成囊胚，形成囊胚率为32.8%。

2.2 囊胚与妊娠结局的关系 新鲜胚胎移植中，有囊胚形成组8 2 个周期，无囊胚形成组4 1 个周期，有囊胚形成组种植率、临床妊娠率高于无囊胚形成组（P<0.05），两组间流产率相比，无明显差异（P>0.05），具体见附表1。

2.3 冻融囊胚及冻融卵裂胚的移植结果 冻融囊胚组种植率及临床妊娠率高于冻融卵裂胚组（P<0.05），两组间流产率无显著差异（P>0.05），具体见附表2。

3 讨论

体外受精－胚胎移植是一种人工生育技术，这种技术的发展为许多的不孕不育患者带来了福音。但这种该技术在进行实施的过程中，也出现了许多的问题，诸如多胎妊娠、异位妊娠、自然流产、胎儿畸形等，因此对这种技术要加以改进，通过改进囊胚的培养及移植技术，提高胚胎种植率及妊娠率。目前，我国多数地方都是将优质胚胎冷冻保存，低级别的胚胎丢弃，造成了胚胎的浪费。随着体外技术的发展，研究人员发现，当部分低级别的胚胎经过继续培养后可发育成囊胚，从而提高了胚胎的利用率和临床妊娠率。

附表1 有囊胚形成组和无囊胚形成组的妊娠结局比较(n，%)

附表2 冻融囊胚及冻融卵裂胚的移植结果比较(n，%)

在进行囊胚培养时可依据发育潜能选取胚胎，且更加符合生理，由于在正常条件下，早期胚胎是在输卵管中发育的，直到囊胚期才会进入子宫腔，进行着床，囊胚移植减轻了胚胎被排除宫腔的几率，提高了着床率，降低异位妊娠的几率。

从上述实验结果中，可以看出，低级别的胚胎通过囊胚培养，可以筛选出最具潜能的胚胎，提高了胚胎的利用率和临床妊娠率。