低氧复合运动抑制低氧诱导的骨骼肌NLRP3炎性小体活化

张子怡 薄海 杨爽 王天添 袁瑶 张勇

1天津体育学院天津市运动生理学与运动医学重点实验室（天津 300381）

2武警后勤学院军事训练医学教研室（天津 300309）

低氧（hypoxia）是呼吸系统疾病、心血管疾病、血液疾病、高原病等的重要病理表征，表现为细胞氧供应不足或氧利用障碍。骨骼肌是机体主要的氧利用器官。研究表明，长期低氧暴露造成骨骼肌肌纤维横截面积减小，收缩耐受性和肌力降低，严重影响机体作业能力和生活质量[1]。探讨低氧损伤骨骼肌的病理机制及有效防护措施具有重要意义。研究表明，低氧环境下中等强度的运动训练，即低氧复合运动（exercise train⁃ing in hypoxia）可有效抑制低氧诱导的骨骼肌蛋白降解和细胞凋亡，促进毛细血管生成以提高低氧状态下肌肉组织的氧气供应[2]。

炎症反应是低氧损伤的重要病理机制之一[3]。NL⁃RP3炎性小体（NLRP3 inflammasome）是机体固有免疫系统的重要成员，由识别蛋白NOD样受体、衔接蛋白凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和效应蛋白天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1（caspase-1）共同组成。NOD样受体识别应激源后聚集为NLRP3寡聚体，通过ASC募集并激活caspase-1，活化的caspase-1切割炎症因子白介素1-β（IL⁃1β），使之成熟以参与炎症反应[4]。研究表明，低氧状态下骨骼肌NLRP3炎性小体活性及其调控的IL-1β含量明显升高[5]。提示NLRP3炎性小体活化是机体应答低氧的重要环节。

研究表明，线粒体功能障碍产生高水平活性氧（ROS）是NLRP3炎性小体活化的重要因素[6]。人红细胞衍生核因子2样蛋白2（Nrf2）是细胞中应答氧化应激，并调控抗氧化酶系表达的重要转录因子[7]。研究表明，上调Nrf2[8]或抑制NLRP3炎性小体活化[9]均可有效减轻细胞缺血/缺氧损伤。但Nrf2是否参与NLRP3炎性小体对低氧的应答尚不清楚。我们前期证明，低氧复合运动可有效改善低氧状态下骨骼肌线粒体质量，同时上调抗氧化酶表达[10]。本研究观察低氧复合运动是否能抑制低氧诱导的NLRP3炎性小体活化，并探讨Nrf2在其间的生物角色。

1 材料与方法

1.1 动物分组与干预方案

32只健康雄性Sprague-Dawley大鼠，体重201～233 g，随机分为4组：常氧组（normoxia control group，NC）、常氧运动组（normoxia and exercise training group，NT）、低氧组（hypoxia control group，HC）和低氧复合运动组（hypoxia and exercise training group，HT），每组8只。HC组和HT组进行低氧暴露干预，参照本组前期工作[10]，将大鼠饲养于常压低氧帐篷，氧气浓度设置为11.3%，正常进食进水，光照12 h/d，持续4周。HT组大鼠每日一次置于低氧帐篷内，小动物跑台中行跑台训练（5°，15 m/min），1 h/d，5 d/w，持续4周。NC和NT组大鼠于常氧帐篷内饲养，NT组大鼠于常氧帐篷内小动物跑台训练，训练方案同HT组。各组大鼠末次低氧后即刻断头处死，组织剪分离双侧股四头肌，单侧肌肉在动物处死1 h内提取线粒体，另一侧肌肉于－80℃冻存，用于Caspase-1活性、IL-1β含量和蛋白表达检测。

1.2 检测方法

1.2.1 线粒体ROS产生速率测定

参照本组前期工作[11]，采用差速离心法纯化线粒体，考马斯亮蓝法测定样品蛋白浓度。0.5 mg线粒体加入反应介质中，加入5 mmol/L苹果酸和10 mmol/L谷氨酸启动线粒体态2呼吸，再加入5 μmol/L还原型二氯荧光素，37℃避光水浴15 min，充分反应后置于荧光分光光度计（激发波长499 nm，发射波长521 nm）连续检测10 min，计算线粒体ROS产生速率。

1.2.2 线粒体DNA中8-oxodG含量测定

严格按照试剂盒（Biovision）说明书纯化mtDNA。参照我们前期工作[12]，高效液相色谱法检测线粒体DNA中8-oxodG含量。采用粒径为4 μm的C18反相色谱柱（250 mm×4.6 mm），流动相使用用10 mM醋酸，30 mM氢氧化钠，12.5 mM柠檬酸，25 mM醋酸钠，6%甲醇，流速0.8 mL/min，测量波长为260 nm。试剂盒内8-oxodG标准品制备标准液，同等条件下绘制标准曲线。换算样品中8-oxodG含量。

1.2.3 骨骼肌Caspase-1活性测定

500 mg骨骼肌组织置于组织裂解液（0.1 mmol/L十二烷基硫酸钠、0.5 mmol/L鹅去氧胆酸钠、10 μmol/L抑酞酶和5 μmol/L苯甲基磺酰氟化物），裂解1 h后离心（8000 r/min），收集上清，考马斯亮蓝法检测蛋白浓度。取200 μg样品蛋白加入50 μL反应介质（组织裂解液+1mmol/L YVAD-AFC），避光反应1 h，终产物于微量荧光酶标仪检测。NC组Caspase-1活性定义为1，NT、HC、HT组Caspase-1活性为与NC组比较的相对活性。

1.2.4 骨骼肌IL-1β 含量测定

采用ELISA法检测。严格按照大鼠IL-1β定量酶联检测试剂盒说明书操作，于微量荧光酶标仪检测各组骨骼肌IL-1β含量。

1.2.5 Western blot法检测NLRP3、ASC、Nrf2和NQO 1蛋白表达

以β-actin为内参。将骨骼肌组织匀浆根据浓度不同加入SDS上样缓冲液加热处理5 min。10 μg蛋白样品经SDS-PAGE电泳分离后，湿转于PVDF膜上。1∶2000对应一抗孵育过夜，漂洗后用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1 h，充分漂洗后用荧光显色试剂盒显影，X-ray胶片曝光记录，扫描各条带灰度值。NC组条带灰度值定义为100%，NT、HC和HT组为与NC组比较的相对表达量。

1.3 统计学分析

数据用均数±标准差（±s）表示，使用SPSS 13.0统计软件中双因素方差分析进行组间比较，P＜0.05定义为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 线粒体DNA中8-oxodG含量和ROS产生速率

HC组线粒体DNA中8-oxodG含量显著高于NC组（P＜0.01），HT与HC组线粒体ROS产生速率显著高于NC组（P＜0.05，P＜0.01）。HT组线粒体DNA中8-oxodG含量及ROS产生速率显著低于HC组（P＜0.01）（表1）。

表1 各组线粒体DNA中8-oxodG含量及ROS产生速率的变化

2.2 骨骼肌NLRP3和ASC蛋白表达

HT与HC组骨骼肌NLRP3蛋白表达显著高于NC组（P＜0.05，P＜0.01），HC组ASC蛋白表达显著高于NC组（P＜0.01）。HT组NLRP3和ASC蛋白表达均显著低于HC组（P＜0.05，P＜0.01）（图1）。

图1 各组骨骼肌NLRP3和ASC蛋白表达的变化

2.3 骨骼肌Caspase-1活性和IL-1β 含量

HC组骨骼肌Caspase-1活性显著高于NC组（P＜0.01），HT与HC组IL-1β含量显著高于NC组（P＜0.05，P＜0.01）。HT组Caspase-1活性和IL-1β含量均显著低于HC组（P＜0.05，P＜0.01）（表2）。

2.4 骨骼肌Nrf2和NQO1蛋白表达

HC组骨骼肌Nrf2和NQO1蛋白表达均显著低于NC组（P＜0.05，P＜0.01）。HT组Nrf2和NQO1蛋白表达均显著高于HC组（P＜0.01）（图2）。

表2 各组骨骼肌Caspase-1活性和IL-1β含量的变化

图2 各组骨骼肌Nrf2和NQO1蛋白表达的变化

3 讨论

作为细胞固有免疫的重要组分，NLRP3炎性小体活化是抵御病原微生物等危险因素侵袭的关键环节。但过度且持续的NLRP3炎性小体活化参与糖尿病、肿瘤等一系列疾病发生[4]。本研究中4周低氧暴露明显活化大鼠骨骼肌NLRP3炎性小体，表现为NLRP3炎性小体的三个关键组分NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达增加，同时caspase-1活性及IL-1β含量升高。研究表明，IL-1β可通过活化泛素-蛋白酶体途径参与低氧状态下骨骼肌蛋白降解，导致肌肉萎缩。此外，IL-1β刺激其它细胞因子和趋化因子释放，诱导组织炎性细胞浸润，进一步加重骨骼肌损伤[13]。Cero等[14]报道，低氧暴露下，衔接蛋白ASC敲除小鼠肺动脉平滑肌受损程度显著低于野生型小鼠。以上提示，NLRP3炎性小体活化介导的炎症反应是骨骼肌低氧损伤的病理机制之一。

本研究中，4周低氧复合运动明显抑制了低氧诱导的骨骼肌NLRP3炎性小体活化。Wang等[15]在抑郁症模型小鼠中也发现，4周有氧耐力训练显著抑制海马组织NLRP3炎性小体活化。以上提示，运动训练可在病理状态下通过调控NLRP3炎性小体抑制炎性损伤。所有的NLRP3炎性小体活化因子，如Toll样受体激活物、炎性因子、组织蛋白酶等，均可诱导ROS大量产生[4]。这表明ROS在NLRP3炎性小体活化中的关键作用。研究表明，线粒体自噬障碍导致受损线粒体积累，产生过量ROS并激活NLRP3炎性小体[6]。此外，Oka等[16]报道，mtDNA氧化损伤后可从受损线粒体中释放，直接结合并激活NLRP3炎性小体。本研究中，低氧复合运动明显降低了低氧诱导的骨骼肌线粒体ROS产量和mtD⁃NA中8-oxodG含量。以上提示，低氧复合运动可通过抑制ROS产生及mtDNA氧化损伤，下调低氧状态下NLRP3炎性小体活化水平。

线粒体ROS的量由其产生能力和抗氧化酶系清除能力共同决定。Nrf2与其负调节蛋白Keap1结合而处于无活性状态，ROS或亲电子物质促进Nrf2与Keap1脱偶联，转位入细胞核与DNA中抗氧化反应元件（ARE）结合，调控血红素氧化酶1（HO-1）、超氧化物歧化酶（SOD）、醌氧化还原酶1（NQO1）等一系列抗氧化酶的表达[7]。本研究中，4周低氧暴露显著抑制骨骼肌Nrf2及其下游NQO1的表达。Shimizu等[17]报道，缺血早期心肌Nrf2表达迅速上调，但随着缺血时间的延长，Nrf2表达逐渐降低。ROS是Nrf2活化的启动因素，但持续高水平氧化应激会活化胞核抑制因子Bach1，竞争性抑制Nrf2与ARE基因结合[18]。此外，前列腺素F2α参与调控Nrf2的泛素化和降解[19]。而慢性低氧上调骨骼肌前列腺素F2α表达[20]。这可能是长期低氧抑制骨骼肌Nrf2表达及转录活性的机制之一。

本研究中，低氧复合运动抑制了低氧对骨骼肌Nrf2及其下游NQO1的下调效应，这与ROS和NLRP3炎性小体的变化趋势一致。Liu等[21]报道，在腹膜炎模型中，Nrf2-/-小鼠巨噬细胞ROS产生增加，同时NLRP3炎性小体活化水平及IL-1β含量显著高于野生型小鼠。证明Nrf2参与对NLRP3炎性小体的调控。他们还发现，Nrf2-/-小鼠给予抗氧化剂TBHQ灌胃，NLRP3炎性小体活性被抑制，而ARE相关抗氧化酶中仅NQO1表达升高[21]。表明NQO1清除过量ROS是Nrf2调控NLRP3炎性小体的关键环节。此外，Nrf2可与p62直接结合以上调线粒体自噬，参与线粒体质量控制[22]。我们前期证明低氧复合运动可提高骨骼肌PINK1和Bnip3介导的线粒体自噬[11]。以上表明Nrf2参与了低氧复合运动对NLRP3炎性小体的抑制效应。

4 总结

低氧复合运动可上调Nrf2表达，并至少通过两条途径减少低氧诱导NLRP3炎性小体活化的因素，降低骨骼肌炎性反应：1）提高线粒体健康水平以抑制ROS产生；2）上调抗氧化酶NQO1等抗氧化酶表达，增加ROS清除能力，并抑制线粒体DNA氧化损伤。