衰老过程中有氧运动干预对海马突触可塑性及PDE-4基因表达的影响

张树玲 李雪 袁琼嘉 王璐

1成都体育学院运动医学与健康学院运动医学与健康研究所（四川成都 610041）

2成都体育学院运动医学与健康学院运动人体科学系（四川成都 610041）

1 引言

脑是机体最高调节中枢，神经系统由神经元借突触连接，并依赖突触来实现脑的调节功能。突触结构和功能的完整性是神经元获取、传递、加工分析、贮存信息的重要前提和保证。衰老可导致脑萎缩，表现为神经元及神经胶质细胞数量减少，形态、结构、组成、功能均发生改变；机体表现出学习记忆、分析、反应、判断、推理等能力减退[1]。有研究指出，虽然衰老大脑某些部位神经元已有不同程度的损伤，其功能却维持在一定的水平，提示可能存在一定程度的脑功能代偿，神经系统具有一定程度的可塑性，即神经元间有建立突触联系的能力。在这一过程中，突触对内外刺激极为敏感，其可塑性能力的改变对神经系统的功能影响重大。突触素（synaptophysin，Syp）是位于突触囊泡膜上的特异性蛋白质，是突触前终末的特异性标记物，可用于检测突触的数量及密度，是突触结构可塑性的重要标志之一[2]。代谢型谷氨酸受体（metabotropic gluta⁃mate receptor，mGluRs）与G蛋白偶联，参与胞内多种信使系统介导的慢突触传递[3]。其中，代谢型谷氨酸受体1（metabotropi glutamate receptor 1，mGluR1）可作为突触可塑性的代表性指标之一[4]。磷酸二酯酶-4（Phos-phodiesterase 4，PDE-4）是细胞内第二信使环腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）特异性水解酶，可通过对cAMP信号转导的调控，改善认知记忆，维持和促进神经细胞的生存，阻断药物依赖的形成及抗抑郁等作用，进而改善脑功能障碍[5]。有关运动影响脑功能机制的研究主要包括神经发生、突触可塑性、树突棘密度和血管新生等[6]。运动对海马的积极作用可能是通过调节海马突触可塑性实现的，主要表现为提高海马DG区神经发生，增加树突棘密度，促进血管新生，特别是有助于长时程增强（long-term potentia⁃tion，LTP）等[7]。但是，关于有氧运动对衰老过程中大鼠海马Syp和mGluR1表达以及PDE-4基因的影响仍不清楚。本研究通过成功建立D-半乳糖衰老动物模型，并在建模过程中对大鼠进行中等负荷有氧运动干预，观察大鼠衰老过程中进行有氧运动干预对海马突触可塑性及PDE-4基因表达影响，分析指标变化之间的相互关系及可能作用机制。

2 材料与方法

2.1 动物建模及取材

成年3月龄雄性SPF级SD大鼠45只，体重400±20 g，购于成都达硕生物有限公司[生产许可证号：CSXK（川）2008-24]。大鼠分笼饲养，自由饮食。室温24±2℃，相对湿度45%～60%，国家标准啮齿类动物饲料喂养。适应性喂养1周后随机分为3组：对照组（C组，n=15）、D-半乳糖致衰老模型组（A组，n=15）、D-半乳糖致衰老+有氧运动干预组（AE组，n=15）。A组、AE组采用“腹腔注射D-半乳糖法”建立亚急性衰老动物模型，根据大鼠体重注射量为100 mg/kg/d[8（]D-半乳糖用生理盐水稀释成5%浓度，即浓度为2 ml/kg/d的D-半乳糖生理盐水溶液），C组大鼠则根据体重每天注射一次相同剂量的生理盐水，均连续注射6周。有氧运动干预方式采用中等负荷游泳运动[9]，在自制透明的玻璃缸（160 cm×60 cm×110 cm）内进行，水深80 cm，水温34±2℃[8，9]。在建模过程中，AE组大鼠进行游泳运动（不负重），60 min/天，6天/周，为期6周，其余两组不进行游泳运动。实验结束后，大鼠断头取脑，用冰冷生理盐水漂洗，除去血液，冰上切割，剥离海马，分装入冻存管中，迅速投入液氮中保存备用。

2.2 指标检测

2.2.1 大鼠海马神经元尼氏染色

制备石蜡切片，依次进行二甲苯溶液Ⅰ脱水7 min，二甲苯溶液Ⅱ脱水7 min，梯度酒精溶液脱水2 min。之后于37℃恒温箱中2%硫瑾溶液染色8 min，流水冲洗5 min，90%酒精溶液脱色数秒（光学显微镜观察脱色情况以便控制时间，一般情况下酒精溶液浓度越低脱色越快），95%酒精溶液脱水1 min，再依次进行二甲苯溶液Ⅲ透明5 min，二甲苯溶液Ⅳ透明5 min，之后中性树胶封片，于显微镜下观察拍照。

2.2.2 大鼠海马Syp、mGluR 1免疫荧光检测

冰冻的海马组织切割成矢状切片（厚度约4 μm），室温至霜除（约5 min），于4℃下4%多聚甲醛固定10 min，室温PBS洗1 h，在37℃下孵育一抗2 h，4℃过夜，第2天在避光条件下，室温PBS洗1 h，在37℃下孵育二抗1 h，室温PBS洗1 h，DAPI溶液染核，室温PBS洗40 min，双蒸水洗10 min，90%甘油封片。利用激光共聚焦扫描显微镜采集图像，Image pro-plus软件进行图像处理分析，计算积分光密度（integral optical densi⁃ty，IOD值）。

2.2.3 大鼠海马PDE- 4基因Real Time-PCR 检测

采用Trizol法提取海马组织总RNA：取适量海马组织，样品按50～100 mg组织加入1 ml冰Trizol；利用分光光度计（Thermo Scientific NanoRop 2000）测定RNA含量，并估算其纯度及浓度；用2%琼脂糖凝胶分析总RNA的完整性；采用BIO-RAD iScriptTMcDNA Synthe⁃sis Kit试剂盒将RNA反转录成活性稳定的cDNA；采用SsoAdvancedTMSYBR®Green Supermix试剂盒进行Re⁃al-Time PCR扩增反应。由TaKaRa宝生物工程有限公司设计并合成引物序列：β-actin上游序列为5’-CgT AAA gAC CTC TAT gCC AAC A-3’，下游序列为5’-Tag gAg CCA ggg CAg TAA TC-3’，产物长度为99bp；PDE-4上游序列为5’-Agg AgA AAT CAg CgT Tgg AgA-3’，下游序列为5’-TTg Tag ATg gTg Agg gTA gAg gA-3’，产物长度为171 bp。反应结束后，先观察PDE-4和β-actin标准曲线的扩增效率是否接近100%，溶解曲线是否为单一峰以确定PCR的特异性。之后采用2-△△CT（Livak）的方法进行数据处理，比较各组间 PDE-4基因表达水平的差异性数据，由Bio-Rad CFX Manager system自动分析，生成数据及图像。

2.2.4 大鼠海马PDE- 4蛋白Western Blotting ting检测

取适量海马组织称重，按1 mg组织/20 μl裂解液比例加入RIPA裂解液（含PMSF）进行蛋白提取，严格按BCA蛋白浓度测试试剂盒说明书进行总蛋白浓度的测定；将上样缓冲液（2×loading Buffer）与蛋白质按1︰1的比例均匀混合，约在100℃水浴锅加热变性10 min，冷却分装，-20℃保存待用；进行SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白及marker转移至 PVDF膜，用5%脱脂奶粉室温下将PVDF膜封闭1 h，用同样浓度的脱脂奶粉溶液稀释一抗（ab9018，浓度1︰1000），4℃封闭过夜；第2天，室温TBST液洗8×5 min，用同样浓度的脱脂奶粉溶液稀释二抗（山羊抗小鼠lgG/辣根酶标志，浓度1︰2000），37℃封闭孵育2 h；之后室温TBST液洗8×5 min，进行AB显色；暗室内显影；将所得PDE-4和β-ac⁃tin胶片进行扫描，获得图片，再应用Quantity One分析软件上的条带轨迹，用定量分析方法（TraceTracking）对图片条带进行灰度值分析，将各组PDE-4与其β-ac⁃tin值相比，以比值作为目的蛋白表达量。

2.3 统计学方法

利用SPSS19.0统计软件进行数据分析，以±s表示结果。采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行组间比较，P＜0.05表示差异性显著，P＜0.01表示差异性非常显著；运用Spearman等级相关及Pearson积差相关判断各指标间的相关性。

3 结果

3.1 大鼠一般状态观察结果

C组大鼠精神良好、动作敏捷、食欲良好、体毛光泽、体形健硕等；A组大鼠精神不振、嗜睡、动作迟缓、无食欲、体毛枯黄卷曲、体形瘦弱等，呈现衰老体征；AE组大鼠精神状态、食欲情况、体毛颜色、体形等情况均与C组大鼠相似，未出现衰老体征。

3.2 大鼠海马神经元尼氏染色结果

各组大鼠海马神经元尼氏染色在40倍光镜下结果：C组大鼠海马神经元数量正常，排列整齐有序，细胞间距均匀，胞质中尼氏体着色匀称；A组大鼠海马神经元数量明显减少，排列紊乱，细胞间距增大，胞质中尼氏体着色变浅；AE组大鼠海马神经元数量、排列情况、细胞间距、胞质中尼氏体着色等情况与C组相似。见图1。

图1 各组大鼠海马DG区神经元尼氏染色

3.3 大鼠海马Syp、mGluRm1免疫荧光检测结果

3.3.1 大鼠海马Syp免疫荧光检测结果

大鼠海马Syp免疫荧光染色结果见图2。与C组比，A组大鼠海马Syp免疫荧光染色IOD值非常显著性降低（P＜0.01）；与A组比，AE组大鼠海马Syp免疫荧光染色IOD值非常显著性升高（P＜0.01）。见表1。

图2 各组大鼠海马DG区Syp免疫荧光染色结果

表1 各组大鼠海马Syp免疫荧光染色IOD值比较（±s）

表1 各组大鼠海马Syp免疫荧光染色IOD值比较（±s）

注：与C组比：▲▲P＜0.01；与A组比：★★P＜0.01

C组596.59±27.32 AE组589.18 ± 36.68★★A组422.34 ± 32.17▲▲

3.3.2 大鼠海马mGluR 1免疫荧光检测结果

大鼠海马mGluR1免疫荧光染色结果见图3。与C组比，A组大鼠海马mGluR1免疫荧光染色IOD值非常显著性降低（P＜0.01）；与 A 组比，AE组大鼠海马mGluR1免疫荧光染色IOD值非常显著性升高（P＜0.01）。见表2。

图3 各组大鼠海马DG区mGluR1免疫荧光染色结果

表2 大鼠海马mGluR1免疫荧光染色IOD值（±s）

表2 大鼠海马mGluR1免疫荧光染色IOD值（±s）

注：与C组比：▲▲P＜0.01；与A组比：★★P＜0.01

C组235.21±27.56 A组169.34 ± 22.34▲▲AE组226.56 ± 25.13★★

3.4 大鼠海马PDE- 4 mRNA Real-Time PCR 检测结果

与C组比，A组大鼠海马PDE-4 mRNA表达非常显著性升高（P＜0.01）；与A组比，AE组大鼠海马PDE-4 mRNA表达非常显著性降低（P＜0.01）。见表3。

表3 各组大鼠海马PDE-4 mRNA表达量（±s）

表3 各组大鼠海马PDE-4 mRNA表达量（±s）

注：与C组比：▲▲P＜0.01；与A组比：★★P＜0.01。

C组1.07±0.059 AE组0.88 ± 0.060★★A组1.20 ± 0.041▲▲

3.5 大鼠海马PDE- 4蛋白Western Blotting ting检测结果

与C组比，A组大鼠海马PDE-4蛋白表达非常显著性升高（P＜0.01）；与A组比，AE组大鼠海马PDE-4蛋白表达非常显著性降低（P＜0.01）。见表4、图4。

表4 大鼠海马PDE-4蛋白表达量（±s）

表4 大鼠海马PDE-4蛋白表达量（±s）

注：与C组比：▲▲P＜0.01；与A组比：★★P＜0.01。

C组0.31±0.01 AE组0.02 ± 0.01★★A组0.33 ± 0.01▲▲

图4 大鼠海马免疫印迹条带

3.6 PDE- 4与突触可塑性之间相关性分析

PDE-4 mRNA表达与Syp的IOD值呈非常显著性负相关（P＜0.01），与mGluR1的IOD值呈显著性负相关（P＜0.05）；PDE-4蛋白表达与Syp的IOD值和mGluR1的IOD值均呈显著性负相关（P＜0.05）。见表5。

表5 大鼠海马PDE-4表达水平与突触可塑性检测结果之间的相关系数矩阵

4 讨论

在相关衰老研究中，衰老动物模型的正确选择和成功建立尤其关键[10]。衰老动物模型包括转基因动物模型、自发性动物模型和诱发性动物模型3种[11、12]。D-半乳糖衰老动物模型已成为国内较公认的诱发性衰老动物模型，与其他衰老模型相比，该模型造模周期短，操作简单，创伤性比较小，易于建成，且重复性好，表现出与自然衰老动物相似的体征等[8、13]，已被广泛地应用于白内障、脑老化、延缓脑衰老等方面研究[11]。早期学者发现，衰老时海马神经元出现丢失现象，神经元细胞间距变得疏松[14]。本研究通过6周衰老造模，观察一般状态发现，A组与C组相比，大鼠表现出精神不振、嗜睡、动作迟缓、无食欲、体毛枯黄卷曲、体形瘦弱等明显的衰老体征；在40倍光镜下观察尼氏染色结果发现，与C组比，A组大鼠海马神经元呈现数量明显减少，排列紊乱，细胞间距增大，胞质内尼氏体减少及着色变浅等形态结构退化特征。本研究结果可以证明D-半乳糖脑衰老造模成功。有研究表明8周中等负荷跑台运动能够有效降低海马神经元的凋亡率[15]。刘涛等[16]实验显示，衰老模型训练组大鼠通过6周游泳运动后其海马神经元凋亡细胞数量较衰老模型组显著减少（P＜0.01）。本研究结果中AE组大鼠精神状态、食欲、体毛颜色、体形等一般状态及海马神经元数量、排列情况、间距、胞质中尼氏体着色等海马神经元结构形态均与C组相似，未表现出衰老体征，与上述文献一致，提示衰老过程中有氧运动可能保护和修复海马神经元的形态结构。

突触在内外环境刺激作用下形态和传递效能可发生某些适应性变化，该过程称为突触可塑性（synapse plasticity，Sy）[17]，具体表现为突触结构和功能可塑性。突触功能可塑性按性质不同分为长时程增强（long term potentiation，LTP）和长时程抑制（long term de⁃pression，LTD），可使突触连接增强或减弱，贮存大量信息，是学习记忆的神经基础[18]。Syp是突触前终末的特异性标记物，可用于检测突触的数量和分布情况，是突触可塑性的重要标志之一[2]。Syp对于Ca2+具有高度亲和力，促使突触囊泡与突触前膜融合，使神经递质快速释放[19]，提高突触传递效能。Syp也可激活酪氨酸激酶，促使自身磷酸化，调节内源性神经递质谷氨酸的释放，提高突触传递效能[20]。而突触后致密物（postsynap⁃tic density，PSD）是位于突触后膜质膜下的细胞骨架网，是突触后信号转导和整合的结构基础。LTP形成过程伴随着PSD长度、厚度、面积的增加，推测PSD可能是为突触传递效能增加的物质基础[21]。构成PSD的信号转导相关蛋白质之一的神经递质受体[22、23]分为离子型谷氨酸受体（inootropic glutamate receptor，iGluRs）和代谢型谷氨酸受体（metabotropic glutamate receptor，mGluRs）。其中，mGluRs与多种细胞内第二信使相连，调节中枢神经系统生理及病理过程，如突触可塑性、神经元的退化、神经毒性等[3]。

已有研究表明，运动训练能够增强海马神经元突触可塑性[24]。孙咏虹等[25]实验表明，2个月跑笼运动延缓了快速老化小鼠海马神经元的变性速度，提高了海马突触素表达，进而改善了脑功能。医学领域对于脑缺血及中枢相关性疾病的运动干预有类似的研究。刘传玉[26]探讨了运动康复治疗对局灶脑梗死大鼠脑可塑性的影响，发现运动训练可促进鼠脑梗死后缺血周边区Syp表达量的增加，促进突触的重塑，提高了再建突触的传递效能。刘建锋[27]研究以食物为诱导的意向运动疗法对局灶性脑缺血大鼠皮质缺血区Syp表达的影响，结果发现意向运动疗法可促进局灶性脑缺血大鼠皮质缺血区Syp的表达量上调，进而修复缺损神经，有助于缺损神经功能的恢复。于雪峰等[28]研究发现，运动加针刺康复疗法增加了脑瘫病变皮质区的Syp表达量，修复损伤神经，促进神经功能的康复，有利于恢复脑瘫肢体运动功能。本研究结果表明，各组大鼠海马DG区Syp和mGluR1的IOD值变化趋势一致：A组非常显著性低于C组（P＜0.01），AE组非常显著性高于A组（P＜0.01）。本研究结果与上述文献一致，提示有氧运动可有效防止Syp、mGluR1的丢失，使Syp和mGluR1数量和密度保持在一定水平上，以维持突触可塑性能力，进而改善脑功能，延缓脑衰老。

环腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和环鸟苷酸（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）是生物体内的第二信使物质，参与介导激素、神经递质、多种细胞外信号引发的特定生物学效应，其表达水平对调节细胞的多项生理功能具有重要意义。其中，cAMP参与中枢神经系统短期突触活动，如神经递质合成、储存、释放及其受体的敏感性等[29]。PDEs是细胞内cAMP和cGMP唯一的降解酶，对两者浓度调节起关键性作用。PDEs是一个超级酶家族，PDE-4是PDEs中最大的家族。PDE-4在体内分布广泛，主要分布在脑组织中，是cAMP特异性水解酶[30]。PDE-4通过调节细胞内cAMP/PKA途径和cAMP/细胞外的信号相关激酶途径或延迟cAMP水平升高影响相应蛋白的合成进而引发一系列生物学效应[31]。有研究表明，PDE-4抑制剂使cAMP在细胞内堆积，产生各种生物效应，如抗抑郁、改善认知能力和增强记忆等［32］。新型PDE-4抑制剂氯比普兰可通过增强cAMP/PKA信号通路进而改善老年认知功能及抗抑郁作用[33]。有实验表明［34］，给予毒蕈碱M受体激动剂东莨菪碱可以引起工作记忆和参照记忆的损害，应用PDE-4抑制剂可逆转这两种记忆的损害，并推测这些作用可能与PDE-4抑制剂可以通过增加海马cAMP含量，增加海马神经元LTP，增强海马的突触可塑性有关。但衰老过程中有氧运动对大鼠海马PDE-4基因表达的影响仍不清楚，缺少文献资料。本研究结果表明，各组大鼠海马PDE-4 mRNA及蛋白表达变化趋于一致：与C组比，A组非常显著性升高（P＜0.01）；与A组比，AE组非常显著性降低（P＜0.01）。上述实验结果表明，有氧运动可下调大鼠海马中PDE-4基因表达，也可产生与PDE-4抑制剂相同的效应。相关分析结果显示，Syp的IOD值与PDE-4 mRNA呈非常显著性负相关（P＜0.01），与PDE-4蛋白表达呈显著性负相关（P＜0.05）；mGluR1的IOD值与PDE-4mRNA及蛋白表达呈显著性负相关（P＜0.05）。PDE-4的表达水平可准确地反映海马突触可塑性，推测有氧运动可以通过下调PDE-4的表达水平，进而提高海马突触可塑性，改善神经系统能力，最终起到延缓衰老的作用。

5 结论

（1）衰老过程中进行有氧运动干预可以修复海马神经元的形态结构，使Syp和mGluR1数量和密度保持在一定水平上，以维持突触可塑性，进而改善脑功能，延缓脑衰老。

（2）运动可能通过下调PDE-4基因表达影响脑功能。