温度对雌雄葎草生理代谢及保护酶系统影响的性别差异

郭海燕，段婧，刘金平*，游明鸿，谢瑞娟

(1.西华师范大学西南野生动植物资源保护省部共建教育部重点实验室，四川 南充 637009；2.四川省草原科学研究院，四川 成都 611731)

温度对雌雄葎草生理代谢及保护酶系统影响的性别差异

郭海燕1，段婧1，刘金平1*，游明鸿2，谢瑞娟1

(1.西华师范大学西南野生动植物资源保护省部共建教育部重点实验室，四川 南充 637009；2.四川省草原科学研究院，四川 成都 611731)

以雌雄异株攀援草本植物葎草为材料，依据野生资源主要分布地域的平均温度，设置3个温度(15, 20, 25 ℃)为变量，通过测定光合指标、代谢指标、抗氧化酶活性指标和细胞膜完整性指标，分析温度对葎草光合作用、呼吸作用及抗逆性影响的生理变化，研究温度对雌雄葎草生理代谢及保护酶系统影响的性别差异。结果表明，温度显著影响葎草叶中的叶绿素含量，Pn和单株生物量随温度下降显著减小(P<0.05)，♀株的潜在Pn显著大于♂株(P<0.05)；♂株的糖代谢和呼吸作用显著高于♀株(P<0.05)，氮代谢性别间无显著差异(P>0.05)，温度对可溶性糖(SS)、丙酮酸(PA)含量和硝酸还原酶(NR)有显著影响(P<0.05)，随温度下降SS含量逐步增加(P<0.05)，NR活性逐步降低(P<0.05)，温度对代谢速率影响远大于性别间的差异。温度对SOD和POD活性有极显著影响(P<0.01)，对CAT活性有显著影响(P<0.05)，随温度降低3种酶活性均不断增加，♀株中SOD和POD含量显著高于♂株(P<0.05)，性别间CAT含量无差异。温度对细胞膜完整性物质含量的影响，远大于性别间差异，随温度降低葎草体内H2O2、丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)和可溶性蛋白(SP)含量均显著增加，♂株中H2O2和SP含量显著高于♀株(P<0.05)，♀株中MDA和Pro含量显著大于♂株。温度对光合作用、呼吸作用、抗氧化酶系统及细胞膜完整性的影响有显著的性别差异，♀株比♂株有更强的适应温度胁迫的生理基础。

葎草；雌雄异株；新陈代谢；抗氧化酶；细胞膜完整性

集雌雄异株植物的性别分化性、攀缘植物对外界支持物的依赖性、草本植物的短寿命性等特点于一身，雌雄异株攀缘草本植物面临生境胁迫时，要求其充分适应与利用生境条件，采取复杂、完善、高效、系统的生长策略，顺利完成短暂的生活史，才能在残酷的自然选择中保证物种的延续。雌雄异株植物维持种群稳定性的能力较为薄弱，光合作用能力、生物量分配、水分利用效率及开花授粉等方面均易受环境胁迫的影响[1]。应对环境胁迫时，雌雄个体生长、形态、生理、生殖及抗逆性等方面表现出明显的性别差异[2], 常引起种群内雌雄性比例失衡，种群繁殖能力下降，导致种群的组成、结构和功能发生改变。若雌雄异株攀缘草本植物遭遇胁迫时，雌、雄株不能及时、同步、协调、匹配地采取有效的应对措施，使物质能量在生长、生殖和抗性等功能间合理分配，保证生活史的顺利完成，且产生充足、健康的种实后代，必将造成物种的濒危或灭绝。

桑科葎草属植物葎草(Humulusscandens)作为药用、饲用、生态绿化、工业原料及水土保持材料等方式利用[3]，且广泛分布的雌雄异株草本攀缘植物，是研究该类植物生殖分配与繁殖策略的理想材料。目前，关于葎草的研究主要集中在营养成分、药物成分、饲喂效果评价及对其他生物的化感作用方面[4-6]，对性别分化导致的种群性比、雌雄株形态、生殖特点、种子发育等方面进行了较为浅显的研究[7-9]，对生境胁迫下形态塑性及繁殖策略进行了初步的研究[10-14]。关于温度对雌雄异株植物的生长发育、生理应激及生殖过程影响研究极少。温度是植物生长的主要生境因子之一，温度通过改变植物体内酶的组成、比例与活性，影响植物的光合、呼吸、蒸腾作用等代谢过程，改变有机物的合成、运输和累积速度，从而影响植物的生存、生长及生殖过程。常通过三基点温度研究适合植物生长发育与存活的温度范围，而最适与最高(低)之间其他温度对植物生理、生长、生殖的影响更加普遍。雌雄个体能否依据立地温度，及时形成生理应激机制，调整和改变同化、异化速率，使物质与能量在生长、防御、抗逆等功能间合理平衡分配，对雌雄异株草本攀缘植物的生长、生殖及物种留存有决定性意义。

本试验依据葎草主要分布地域的生长季的平均温度，采用人工气候培养箱，设置温度为唯一变量。通过测定雌、雄株的叶绿素含量、光合速率、潜在光合速率和单株生物量，分析温度对光合生理的影响；通过测定可溶性糖(SS)、丙酮酸含量(PA)和硝酸还原酶(NR)活性，研究温度对糖代谢、氮素代谢及呼吸作用的影响；通过测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性，探究温度对抗氧化酶系统的影响；通过测定丙二醛(MDA) 、脯氨酸(Pro)、可溶性蛋白(SP)和过氧化氢(H2O2)含量，探讨温度对细胞膜完整性的影响。研究温度对雌雄葎草生理代谢及保护酶系统影响的性别差异，以期为胁迫环境下葎草个体发育、种群形成、适应度及种群扩繁等研究奠定基础，为雌雄异株草本攀缘植物资源的保护利用提供科学借鉴。

1 材料与方法

1.1试验材料及设计

于2015年3月以野生葎草种子为材料，采用高34 cm、口径50 cm花盆，以河沙∶腐殖土1∶1均匀混合为基质，按10粒/盆播种，共30盆。在25 ℃下培养，幼苗1～2对真叶时，随机按3株/盆定苗(避免人为造成性比例失衡)。10盆为1组，分别移入15，20，25 ℃的人工气候培养箱(ZRX-1000DC)，设光照12 h/黑暗12 h，光照强度1300 lx，相对湿度32%下进行培养。待花芽分化现花序识别雌雄时，按性别每株取由上而下第3叶进行光合测定后，摘取、剪碎、混合后保鲜备用，测定生理指标。

1.2测定项目与方法

1.2.1光合指标测定 叶绿素含量采用乙醇丙酮混合提取法[14]。用LI-6400便携式光合仪，光照强度1300 lx下测现实光合速率，在有效辐射为850 μmol/(m2·s)(光响应曲线表明该光照下Pn最大)的内置光源下测潜在光合速率，于第3叶中部随机3点连续采集3个值。每组随机选雌、雄各3株，在105 ℃下烘至恒重后，称单株生物量。

1.2.2代谢指标测定 用“苏州科铭生物有限公司”生产的试剂盒，测定可溶性糖(SS)、丙酮酸(PA)含量和硝酸还原酶(NR)活性[13]。

1.2.3抗性指标测定[14]超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法，过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚法，过氧化氢酶(CAT)活性测定采用紫外吸收法。

1.2.4受伤害指标测定[15]丙二醛(MDA) 采用硫代巴比妥酸(TBA)法，脯氨酸(Pro)采用酸性茚三酮法，可溶性蛋白(SP)含量测定采用考马斯亮蓝G-250染色法，过氧化氢(H2O2)含量采用钼酸法。

1.3数据分析

用SAS 10.0软件对所有数据进行方差分析和析因分析，并用Duncan法对各参数进行显著性检验(SNK检验)。

2 结果与分析

2.1温度对光合指标的影响

叶绿素含量在性别间无显著差异(P>0.05)，♀株的Pn和生物量显著大于♂株(P<0.05)(表1)。3个温度下♀株的同化能力及物质积累能力均强于♂株。温度对叶绿素含量和Pn有显著影响，20 ℃下叶绿素含量显著低于25 ℃(P<0.05)，15 ℃时恢复到25 ℃的水平；随温度下降Pn和单株生物量显著逐步下降(P<0.05)，15 ℃时Pn值和生物量降为25 ℃时的50%左右。♀株的潜在Pn显著大于♂株(P<0.05)，15 ℃时潜在Pn显著高于其他温度。

表1 温度对叶绿素含量和光合速率影响的SNK检验Table 1 SNK test about chlorophyll content and photosynthesis rate in different temperature

注：♀-雌株，♂-雄株。同列不同大写字母表示性别间差异显著(P<0.05)，不同小写字母表示温度间差异显著(P<0.05)。下同。

Note： ♀-Female，♂-Male. Different capital letters in the same column indicate significant difference between genders at 0.05 level, different lower letters within the same column indicate significant difference among temperatures at 0.05 level. The same below.

方差分析表明，Pn、潜在Pn及单株生物量在性别间和温度间均有极显著差异(P<0.01)(表2)。由F值可见，温度对叶绿素和光合速率的影响大于性别。温度与性别互作对叶绿素含量、Pn及生物量无显著影响。性别影响为生物量>潜在Pn>Pn>叶绿素含量，温度影响为Pn>潜在Pn>生物量>叶绿素含量。

2.2温度对代谢指标的影响

♂株的SS和PA含量显著高于♀株(P<0.05)(表3)，NR活性在性别间无显著差异(P>0.05)。温度对SS和PA含量及NR活性有显著影响(P<0.05)，随温度下降SS含量显著增加(P<0.05)，♂株比♀株增加更快；NR活性显著逐步降低(P<0.05)，♂株和♀株下降无差异。PA含量在25和20 ℃间无显著变化，15 ℃时显著增加。

方差分析说明，性别对SS和PA含量有显著影响(P<0.05)；温度对PA含量有显著影响(P<0.05)，对SS含量和NR活性有极显著影响(P<0.01)(表4)。温度对代谢指标的影响远大于性别，温度和性别对代谢指标无显著交互作用。性别对代谢影响为SS>PA>NR，温度的影响为NR>SS>PA。

2.3温度对抗氧化酶活性指标的影响

♀株中SOD和POD含量显著高于♂株(P<0.05)(表5)，CAT在性别间无差异。温度对3种抗氧化酶活性有显著影响(P<0.05)，随温度降低3种酶活性不断增加，♀株中SOD和POD增加速度大于♂株。SOD和POD在3个温度间有显著差异(P<0.05)，CAT在25和20 ℃时差异较小。从25 ℃到20 ℃，SOD活性增加了30%左右，POD活性增加了3倍左右，CAT活性无显著增加；从20 ℃到15 ℃，SOD活性增加了约6倍，POD活性增加了约80%，CAT活性增加了约50%。

性别对SOD和POD活性有显著影响(P<0.05)，对CAT活性影响不显著 (表6)。温度对SOD和POD活性有极显著影响(P<0.01)，对CAT活性有显著影响(P<0.05)。温度对抗氧化酶活性的影响远大于性别，温度和性别对SOD活性有显著交互作用(P<0.05)。性别和温度对抗氧化酶活性影响均为SOD>POD>CAT。

表2 叶绿素含量和光合速率差异的双因子方差分析Table 2 Two-factor variance analysis about chlorophyll content and photosynthesis rate

注：F值表示F检验的显著性，F越大表示越显著，P值表示概率值。下同。

Note：Fvalue indicate the significance of theFtest,with greaterFvalue means the more significant, andPvalue indicates the probability value. The same below.

表3 温度对SS、PA和NR影响的SNK检验Table 3 SNK test about SS, PA and NR in different temperature

表4 SS、PA和NR差异的双因子方差分析Table 4 Two-factor variance analysis about SS, PA and NR

表5 温度对抗氧化酶活性指标影响的SNK检验Table 5 SNK test about antioxidant enzyme activity index in different temperature

2.4温度对细胞膜完整性指标的影响

性别对细胞膜完整性指标有显著影响，♂株中H2O2和SP含量显著高于♀株(P<0.05)(表7)，♀株中MDA和Pro含量显著大于♂株。温度对细胞膜完整性指标均有显著影响，随温度降低H2O2、MDA、Pro和SP含量均显著增加。25 ℃到20 ℃，H2O2、MDA和SP含量显著增加。 20 ℃到15 ℃，Pro和SP含量显著增大。15 ℃时H2O2、MDA、Pro和SP含量比25 ℃时增加了约1.5倍。随温度降低♂株的H2O2和Pro增加量大于♀株，♂株和♀株的MDA和SP增加量相近。

方差分析说明，性别间H2O2、MDA、Pro和SP含量均有显著差异(P<0.05)，温度间4种物质含量均有极显著差异(P<0.01)。温度对细胞膜完整性物质含量的影响远大于性别，温度和性别对4种物质含量无显著交互作用(P>0.05)。性别对细胞膜完整性物质含量的影响为SP>MDA>H2O2>Pro，温度的影响为Pro>SP>H2O2>MDA(表8)。

表6 抗氧化酶活性指标差异的双因子方差分析Table 6 Two-factor variance analysis about antioxidant enzyme activity index

表7 温度对细胞膜完整性指标影响的SNK检验Table 7 SNK test about cell membrane integrity index in different temperature

3 讨论

3.1温度与光合作用

光合作用实质是植物在系统性酶等生理活性物质促进下， 通过叶绿素吸收、固定光能，经过复杂的系列反应把光能转变为化学能的过程。叶绿素是光合作用的物质基础，其含量及组成极易受生境的影响。觅到合适的支持物可显著增加葎草叶绿素含量[16]，轻、中度水分胁迫也显著增加了叶绿素含量[17]，且增加值无显著性别差异，但重度胁迫下，♂株的叶绿素含量比♀株下降幅度更大。有研究认为在低温下酶活性降低，叶绿素合成受阻且加速降解，使叶绿素含量降低[18]。本试验中，温度对葎草叶绿素含量有显著影响，随温度降低叶绿素含量并非线性下降，15 ℃时叶绿素含量显著高于20 ℃，也许15 ℃未达叶绿素降解低温强度，但限制了叶片开展，造成叶绿体等细胞器密度增大，而使叶绿素含量增加。在支持物、水分、温度胁迫时叶绿素含量无显著性别差异，而♀株的Pn总是显著大于♂株，致使♀株的单株生物量显著大于♂株，因♀株承担孕育子实的任务，高效的光能捕获和利用能力对生殖成功及后代传播具有重要意义。随温度下降葎草的Pn显著下降，温度对光合作用的影响较为复杂，主要通过酶的活性和气孔开合度，影响酶促反应速度和气体通量，致使光合作用底物浓度和反应速度发生改变。可通过胞间CO2浓度(Ci)与气孔导度(Gs)数值变化一致性，判断气孔是否参与光合速率调节[19]，♀株在有限的叶绿素基础上，是否通过气孔调节提升其光合速率有待深入研究。温度下降10 ℃，Pn值可降低50%左右，本文中15 ℃时葎草的Pn值显著低于其他温度，其潜在光合速率则显著大于其他温度，说明低温虽限制了光合酶的活性，但累积了最高的叶绿素浓度。可见在长期低温环境下，葎草形成了更为复杂的系统性光合策略，若外界温度一旦提升，即可激发其光合补偿机制或光合潜力，增加植株生长发育和存活几率。

表8 细胞膜完整性指标差异的双因子方差分析Table 8 Two-factor variance analysis about cell membrane integrity index

3.2温度与物质代谢

可溶性糖(SS)是主要光合产物，是碳水化合物代谢、暂时贮藏和运输的主要行式，也是呼吸作用的主要底物，与植物的抗性有密切关系[12]。植物生长发育实质是可溶性糖经过复杂的合成、分解及转运，转化为结构性物质、生理活性物质及贮藏性物质的过程。温度通过影响光合作用和呼吸作用中系列酶的活性，影响SS的合成与分解，也通过影响蒸腾作用和细胞膜的完整性，改变SS的运转和累积。本文中，温度越低Pn值越小,表明SS的合成越慢，温度越低呼吸作用产物丙酮酸(PA)含量越高,表明SS分解越快，但SS含量逐步增加，可见葎草能够依据温度在生长、生殖和抵御功能间进行物质和能量的权衡性分配，结果与支持物和水分胁迫下相似。3个温度下♂株Pn显著低于♀株，而SS和PA含量均显著高于♀株(P<0.05)，不仅说明♂株的同化作用比♀株更易受温度的影响，且♂株把更多的物质与能量用于抵御生境的胁迫，致使其生物量累积、植株大小、分枝能力低于♀株[17]。硝酸还原酶(NR)活性对无机氮的还原、同化和氨基酸、蛋白质的合成等氮代谢过程起关键的调控作用[20]，氮代谢与糖代谢和呼吸作用密切相关，约25%光合总能量用于氮代谢[21]。温度越低SS和PA含量越高，而NR活性越低，表明氮素代谢受温度影响较大，但未与增强抵御性的糖代谢和呼吸作用同步跟进。3个温度下♂株和♀株的NR活性无显著差异，NR活性与Pn呈现出一致性，或因氮代谢受氮源种类、生态因子、发育阶段以及部位诸多因子的影响[22]，或在胁迫条件下氮代谢主要参与维持生命运转的遗传物质和生理活性物质合成，降低了与糖代谢和呼吸作用的相关性。温度对糖代谢、氮代谢及呼吸作用的影响是极其复杂的系统性过程，本文通过SS和PA含量及NR活性变化，仅说明温度对葎草物质代谢速度的性别差异，说明♂株比♀株承受更大的生存风险。

3.3温度与抗氧化酶活性

正常植物组织中通过各种途径产生活性氧(active oxygen)的同时，也通过抗氧化酶系统来降低或消除活性氧对膜脂的攻击能力，使细胞内自由基的产生和清除处于动态平衡状态。随温度降低葎草中SOD、POD 和CAT活性不断增加，25 ℃到20 ℃，SOD增加30%左右，POD增加3倍左右，CAT无显著增加；从20 ℃到15 ℃，SOD增加了6倍左右，POD增加了80%左右，CAT增加了50%左右。可见温度对抗氧化酶系统的组成和比例有显著影响，或许不同温度对活性氧产生途径、产生器官和产生量有影响。SOD消除H2O2的产生，CAT分解H2O2，而POD主要定向分解叶绿体中的H2O2。20 ℃时，叶绿素显著下降，POD急剧增加，CAT无变化，表明活性氧主要由叶绿体的代谢产生。15 ℃时，3种酶活性均显著增加，尤其SOD急剧上升，表明H2O2产生途径及产生量更为复杂。♀株中SOD和POD含量显著高于♂株，CAT性别间无差异，一方面说明♀株的抗氧化能力强于♂株，一方面说明葎草应对外界胁迫的保护酶系统相当复杂。本实验设置的3个温度下，抗氧化酶活性存在数倍的差异，尤其长期处于恒温条件，葎草均能合理配置资源且协调生长[23]，说明葎草具有极其强大的适应环境能力。

3.4温度与细胞膜透性

当胁迫导致产生的活性氧超过保护酶系统的清除能力，导致细胞膜透性增大，损伤大分子生命物质，引起系列生理紊乱，导致植物受伤。本文中♂株中H2O2含量显著高于♀株，说明♂株细胞膜受到伤害的风险更大。♀株中抗氧化酶活性高，但表征膜脂过氧化作用的最终产物MDA显著大于♂株。♂株通过提高SS和SP含量增加细胞水势，减弱H2O2引起的细胞脱水，♀株通过提高Pro含量维持细胞渗透压。细胞膜完整性指标呈现出显著的性别差异，或许♀株和♂株细胞膜对温度胁迫响应时间及抗性潜力存在差异，有研究表明♂株对水分胁迫响应早于♀株，但抗旱潜力低于♀株[12]。同时♀株和♂株采用了不同调节细胞渗透压的方式，随温度降低♂株的H2O2和Pro增加量大于♀株，♂株和♀株的MDA和SP增加量相近，总体上♂株中H2O2、SS和SP含量显著高于♀株，♀株中MDA和Pro含量显著大于♂株，表明♀株和♂株产生、消除活性氧途径存在差异，或许细胞膜对活性氧伤害的抵抗方式及应对机理存在不同。温度对葎草细胞膜有显著影响，温度越低引起细胞膜伤害的H2O2含量越高，但维持渗透压物质和表征伤害度的物质均逐步增加，且性别主要影响SP含量，温度主要影响Pro含量，到底♀株和♂株在不同温度下采用了怎样的应对机理，有待深入研究。

4 结论

葎草对温度具有极强的适应能力，在25，20和15 ℃的恒温条件下，葎草可以顺利开花，为完成生活史奠定基础；温度对葎草的光合作用、呼吸作用、抗氧化酶系统及细胞膜完整性有显著影响，温度越低光合速率和生物量累积越低、糖代谢和呼吸作用越强、氮代谢则减弱、抗氧化酶活性和细胞膜伤害物质含量越高。3个温度下♂株的光合效率、潜在光合速率、单株生物量显著低于♀株，♂株糖代谢和呼吸作用显著高于♀株，♀株中抗氧化酶含量显著高于♂株，表明♂株生长发育比♀株更易受外界温度的影响，♀株的光合同化能力和抗氧化能力强于♂株。雌雄葎草适应温度的代谢途径和响应机理存在不同，但雌雄个体均能依据温度条件，调整和改变代谢速度和抗性物质含量水平，保证个体的存活且能转入生殖生长，为传花授粉、孕育子实及物种延续奠定了基础。

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GenderdifferencesinphysiologyandenzymeactivityinresponsetotemperatureinHumulusscandens

GUO Hai-Yan1, DUAN Jing1, LIU Jin-Ping1*, YOU Ming-Hong2, XIE Rui-Juan1

1.ChinaWestNormalUniversityandKeyLaboratoryofEducationonSouthwestChinaWildlifeResourecesConservation,Nanchong637009,China； 2.AcademyofSichuanGrasslandScience,Chengdu611731,China

The purpose of the study was to explore gender differences in physiology and protective enzyme activity of dioecious plant species at different temperatures. Seed of the dioecious climbing herbHumulusscandenswere planted in pots; at the 1-2 true leaf stage seedlings were moved to an incubator with three temperature settings (15, 20, 25 ℃) based on the mean temperature of the area of seed provenance origin. Photosynthesis, metabolism, antioxidant enzyme activity and cell membrane integrity were measured. The effect of temperature on photosynthesis, respiration and resistance ofH.scandensto temperature was determined. Temperature significantly affected leaf chlorophyll content, light-saturated photosynthetic rate (Pn) and biomass which significantly decreased with decreasing temperature. ThePnof female plants was always significantly higher than that of males (P<0.05). Soluble sugar (SS) and pyruvic acid (PA) contents and nitrate reductase activity (NRA) were also affected by temperature change (P<0.05); SS content was lower but NRA higher with decreasing temperature. Sugar metabolism and respiration rate of males was significantly higher than females (P<0.05), while nitrogen metabolism was not influenced by gender. Temperature affected metabolism more than gender. Temperature significant affected superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD) and catalase (CAT) (P<0.05) activity which increased with decreasing temperature; SOD and POD activity in females plants were significant higher than those of males (P<0.05) but CAT activity was not influenced by gender. The effect of temperature on cell membrane traits was greater than that of gender. H2O2, malondialdehyde (MDA), proline (Pro) and soluble protein (SP) content also increased significantly with decreasing temperature. Higher H2O2and SP but lower MDA and Pro were observed in male compared to female plants. Our results indicated that gender differences in photosynthesis, respiration, antioxidant enzyme system and cell membrane integrity response to low temperature were of less importance than differences due to temperature.

Humulusscandens; dioecious; metabolism; antioxidant enzymes; cell membrane integrity

10.11686/cyxb2016493http//cyxb.lzu.edu.cn

郭海燕, 段婧, 刘金平, 游明鸿, 谢瑞娟. 温度对雌雄葎草生理代谢及保护酶系统影响的性别差异. 草业学报, 2017, 26(10): 198-206.

GUO Hai-Yan, DUAN Jing, LIU Jin-Ping, YOU Ming-Hong, XIE Rui-Juan. Gender differences in physiology and enzyme activity in response to temperature inHumulusscandens. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(10): 198-206.

2016-12-26；改回日期：2017-03-13

西华师范大学英才科研基金(2017YC0337)和四川省科技支撑计划项目(2011NZ0064)资助。

郭海燕(1993-)，女，重庆合川人，在读硕士。E-mail:1217482599@qq.com

*通信作者Corresponding author. E-mail: jpgg2000@163.com