不同氮素水平对饲用苎麻氮代谢关键酶的影响

陈继康,谭龙涛,喻春明,朱爱国,陈平,王延周,朱涛涛,熊和平

(中国农业科学院麻类研究所，湖南 长沙 410205)

不同氮素水平对饲用苎麻氮代谢关键酶的影响

陈继康**,谭龙涛**,喻春明,朱爱国,陈平,王延周,朱涛涛,熊和平*

(中国农业科学院麻类研究所，湖南 长沙 410205)

苎麻是适于中国南方种植的优质植物蛋白质饲料作物，但缺乏氮素利用的生理基础研究。为了明确氮素水平对饲用苎麻氮代谢相关酶的影响，本研究以氮高效基因型苎麻H2000-03和氮低效基因型苎麻册亨家麻为材料进行了盆栽试验，设置0、6、9、12、15 mmol/L氮素处理水平，分析了苎麻幼苗期(15 d)、旺长期(40 d)和成熟期(54 d)氮代谢及抗性关键酶活性的动态变化特征及相关关系，并采用模糊隶属函数法进行了综合评价。结果表明：(1)随着氮素处理浓度的增加，两个苎麻品种的株高、鲜重及叶片蛋白质含量呈先增加后下降或趋于平稳的趋势，表明苎麻对氮素需求存在最适量，低于或高于最适水平将导致显著的产量降低或报酬递减现象。H2000-03在不同氮素水平下的株高和鲜产均显著高于册亨家麻，在适宜氮素水平下(9～12 mmol/L)叶片蛋白质含量也显著较高，并在高氮胁迫下可维持鲜产，整体表现出较高的生产力和稳产性。(2)在不同生长时期，两个苎麻品种NR活性随氮素浓度的提高逐渐升高，而GS、GOGAT、GLDH、CAT、SOD和POD等酶活呈单峰变化趋势。H2000-03的NR、GS、GOGAT、CAT活性及高氮水平下的SOD、POD活性均高于册亨家麻，而GLDH和低氮水平下的SOD和POD活性较低，整体表现出较高的生理响应和适应能力。(3)苎麻氮代谢与抗性关键酶与其产量和品质变化特征一致，可用于监测、表征苎麻基因型间氮素利用的差异。本研究认为：相对于持续提高氮素用量，苎麻可在适宜的氮素水平下达到生理特性与生产性能的契合，旺长期氮代谢相关酶活性可作为饲用苎麻品种选育的指标之一。

饲用苎麻；氮效率；氮代谢；抗性；酶活性

苎麻(Boehmerianivea)是适于我国南方种植的优质植物蛋白质饲料作物之一[1-2]。大量研究表明充分利用苎麻高蛋白的特性，是其产业高效、可持续发展的基础[3-6]。其合成蛋白质主要依赖土壤氮素的吸收和利用，为获得更高产量的粗蛋白，生产中普遍存在重施氮肥的现象，平均年施氮量达到300～552 kg/hm2[7]。氮肥施用量的持续增高，不仅对作物的贡献越来越小，造成氮肥利用效率普遍偏低，而且可能导致饲料原料中硝态氮含量超标[8]和面源污染问题[9-10]。因此，实施苎麻种植氮肥减施和提高苎麻氮素利用效率具有重要意义。

氮效率的基因型差异在作物间、品种间普遍存在，明确氮高效基因型的生理机制、筛选氮高效基因型，进行品种改良是提高氮素利用效率最有效的措施之一[11-12]。硝酸还原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合酶(GOGAT)是氮素同化过程中的关键酶[13]，GS/GOGAT偶联形成的循环是高等植物氨同化的主要途径，在无机氮转化为有机氮的过程中起关键作用[14]。作物氮代谢及抗性相关酶对氮素的响应机制，决定其生产性能和氮素利用效率[15-16]。大量研究分析了施氮水平对苎麻产量和品质的影响[17-19]，Deng等[20]进行了氮素缺失下苎麻蛋白质组的分析，Zheng等[16]克隆了GS相关基因BnGS1-2并在烟草(Nicotianatabacum)中进行了超量表达，Liu等[15]研究了干旱胁迫及喷施GA3对苎麻POD等酶活性的影响。但目前尚未见不同氮素水平下苎麻相关关键酶的变化特征研究。本研究以氮高效和氮低效苎麻品种为材料设置不同氮素处理水平，对苎麻氮代谢及抗性相关酶进行系统对比分析，明确饲用苎麻对不同氮素水平的生理响应特征，为苎麻氮素利用提升和品种选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1试验区域概况

采用盆栽试验，于2014年在位于湖南省长沙市岳麓区的中国农业科学院麻类研究所温室进行。供试的苎麻基因型为前期水培试验，从30个苎麻资源中筛选出氮低效基因型册亨家麻和氮高效基因型H2000-03，其中册亨家麻在9 mmol/L氮素营养液中的氮素利用效率为15.81%，H2000-03为46.01%。

选取生长状况一致的、嫩梢扦插培育的种苗进行试验。采用盆栽试验，每盆一株。试验塑料盆直径60 cm，高55 cm，每盆装干土30 kg。盆栽用土壤自然风干、过筛去杂后装盆，用水沉实，土壤最大持水量为63.8%，土壤养分含量为：全氮1.01 g/kg，速效氮75.1 mg/kg，速效磷16.25 mg/kg，速效钾37.41 mg/kg，有机质含量2.35 mg/kg。

1.2试验材料与方法

试验设5个处理，用氮素水平分别为0、6、9、12、15 mmol/L的营养液浇灌，代号分别为N0、N6、N9、N12和N15，每个处理3个重复，每个重复15株。为避免水分胁迫影响，每3 d浇300～500 mL营养液，在第3天上午8:00-10:00一次性完成，各处理浇灌量一致。营养液的全生育期60 d，共浇灌20次，总灌水量为8 L。大量元素营养液配方参考Hoagland营养液配方，微量元素营养液配方参考[21]，具体见表1。

表1 大量元素培养液配方Table 1 Components of mass elements in nutrient solution mg/L

2014年5月10日将苎麻扦插苗移栽至花盆中，用清水浇灌培养至7月14日，剪除地上部进行破秆，正式开始氮素处理试验。分别在幼苗期(第15天，7月29日)、旺长期(第40天，8月23日)、成熟期(第54天，9月6日)取样，取样时间为上午10点，取样部位为从顶部数第3～8片功能叶和植株中部韧皮组织，先用液氮固定30 s，然后放入-80 ℃冰箱中保存，用以测定样品相关酶活性，每个样品3个重复。每隔6 d测定一次苎麻株高，测定时间为上午9点，测定方法为地面至主茎叶尖的拉直长度，测定全部植株后平均，观察苎麻生长动态。至60 d，收获苎麻，并测定鲜重。目前饲用苎麻以利用鲜株为主，因此本研究选取鲜重为产量指标。

收获后对整个植株称取鲜重。之后用自来水和蒸馏水冲洗干净，将植株在105 ℃下杀青30 min，再将温度调到75 ℃烘干24 h，最后用粉碎机粉碎。粉碎后的样品经H2SO4-H2O2消化后[15]，对样品中的蛋白质含量按GB/T 6432-1994进行测定。

酶活性的测定，谷氨酸合成酶(GOGAT)活性测定参照郑朝峰等[22]的方法；硝酸还原酶(NR)，谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸脱氢酶(GLDH)活性、过氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量参照《现代植物生理学实验指南》[23]；过氧化氢酶(CAT)活性用H2O2紫外吸收法测定[24]。

1.3数据处理

运用模糊隶属函数法进行排序，隶属函数公式为：R(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)，其中Xi代表指标测定值，Xmin和Xmax代表某一指标的最小值和最大值。

采用Microsoft Excel 2016对所得到的数据进行初步整理和图表绘制，用IBM SPSS statistics 19.0软件进行方差分析和一般线性相关分析。采用Duncan法在0.05和0.01水平上进行多重比较。

2 结果与分析

2.1不同氮素水平对苎麻生长的影响

从苎麻株高的动态变化特征可以看出(图1)，两个不同氮效率的苎麻基因型在0～18 d生长速率较为一致，不同氮素水平下没有显著差异。从6 d开始，苎麻生长速率迅速提升，H2000-03在不同氮素水平下的株高增长速率较册亨家麻平均高22.9%，最大达到33.3%。从18 d开始，施氮与不施氮(N0)相比株高差异迅速加大，且氮高效基因型H2000-03株高增长显著高于氮低效基因型册亨家麻。至60 d收获时，H2000-03在N0、N6、N9、N12和N15处理下的株高分别较册亨家麻高40.1%、71.4%、27.4%、97.6%和73.8%。

分析不同氮素水平下苎麻鲜重产量可知(图2)，在0～9 mmol/L的范围内，随着氮素水平的提高，苎麻鲜重显著增加(P<0.01)。超过9 mmol/L后，H2000-03维持了较高的产量，而册亨家麻则显著下降(P<0.01)。5个氮素水平下H2000-03的鲜重均显著高于册亨家麻。可见，氮高效基因型一方面能够适应较高氮素水平，另一方面能够通过获得更高的产量而显著提升氮素利用效率。

两个基因型苎麻的叶片蛋白质含量均随氮素水平的提高而提高。H2000-03叶片蛋白质含量在N9、N12和N15处理下没有显著差异，但均极显著高于N6和N0处理，N6处理又极显著高于N0处理。册亨家麻叶片蛋白质含量随氮素水平提高的增长趋势与H2000-03相似，但在低氮素水平(N0～N9)的增长率较低，而在高氮素水平(N9～N15)的增长率较高，其中N9处理相对于N0处理册亨家麻增长29.0%，小于H2000-03的65.8%；N15处理相对于N9处理册亨家麻增长10.6%，大于H2000-03的6.2%。

图1 不同氮素水平下苎麻株高动态变化Fig.1 Dynamic of plant height of ramie at different nitrogen levels

图2 不同氮素水平对单株苎麻鲜重和叶片蛋白质含量的影响Fig.2 Effects of different nitrogen levels on fresh yield of single ramie plant and its leaf protein content 同一基因型不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著性(t测验), * 表示两个基因型在同一氮素水平下差异显著(P<0.05)。下同。Small letters indicate significant difference among nitrogen levels (P<0.05), * indicate significant difference between genotypes at the same nitrogen level (P<0.05). The same below.

2.2不同氮素水平对苎麻氮代谢相关酶活性的影响

NR活性随苎麻生长时间表现出先升高后降低的现象，而各时期内均表现为随氮素水平的增加而逐渐升高的现象(图3)。H2000-03的NR活性在幼苗期和旺长期提高比率高于册亨家麻，其中幼苗期两个基因型NR活性N15较N0分别提高80.2%和76.2%，旺长期则分别提高126.4%和74.7%。成熟期N0处理下册亨家麻NR活性仅为29.36 μg/(g·h)，其随氮素浓度提高的增长比率较大。比较两个基因型的差异发现，氮高效基因型H2000-03在所有处理和生育时期均高于氮低效基因型册亨家麻，且在旺长期和成熟期的N15处理下达到显著差异(P<0.05)。

GS活性随苎麻生长时间也表现出先升高后降低的现象，而在3个生长时期内则表现为随氮素水平的提高呈现先升高后缓慢降低的趋势(图4)。H2000-03各生长阶段苎麻GS活性均在N9处理下达到最大值，并在较高浓度氮素处理间保持了较高的水平和比册亨家麻更缓和的变化幅度，尤以旺长期明显。册亨家麻则表现为在N12处理下达到最大值，说明氮低效基因型苎麻需要更高浓度的氮素来促进GS活性的提高。至成熟期，H2000-03的GS活性在低浓度氮素条件下(N0、N6)显著较高，而在高浓度氮素条件下(N9、N12、N15)显著较低(P<0.05)。在同一氮素水平上，幼苗期和旺长期表现为H2000-03显著高于册亨家麻。

GOGAT活性随苎麻生长时间的变化趋势与GS活性相似，表现出先升高后降低的现象，但各生长时期内仅H2000-03表现为随氮素水平的提高呈现先升高后降低的趋势(图5)。册亨家麻在各生长时期内的变化规律不一致，其GOGAT活性变化幅度随苎麻生长推进逐步变小，至成熟期，不同氮素水平间没有显著差异。两个基因型在N9、N12处理下达到GOGAT活性的最大值。H2000-03较册亨家麻不仅在生育期内GOGAT活性较高，还表现出对氮素水平更敏感的特征。

图3 不同氮素水平对各生长时期苎麻硝酸还原酶(NR)活性的影响Fig.3 Effects of different nitrogen levels on nitrate reductase (NR) activity of ramie at different growth periods

图4 不同氮素水平对各生长时期苎麻谷氨酰胺合成酶(GS)活性的影响Fig.4 Effects of different nitrogen levels on glutamine synthetase (GS) activity of ramie at different growth periods

图5 不同氮素水平对各生长时期苎麻谷氨酸合成酶(GOGAT)活性的影响Fig.5 Effects of different nitrogen levels on glutamate synthase (GOGAT) activity of ramie at different growth periods

各生长时期册亨家麻的GLDH活性往往显著高于H2000-03(图6)。各时期内苎麻GLDH活性均表现为随着氮素水平升高逐渐增大的趋势，但当氮素浓度>9 mmol/L时，变化趋于平缓，N9、N12和N15处理间均没有显著差异。GLDH活性随苎麻生长时间的推进表现出逐渐增加的趋势，其中H2000-03和册亨家麻在N9处理下成熟期较幼苗期分别增加88.7%和85.8%，N15处理分别增加109.7%和112.8%。

由表2可以看出，在幼苗期和成熟期，苎麻叶片蛋白质含量与GLDH、NR活性显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)正相关，而与GS、GOGAT活性相关不显著。旺长期苎麻叶片蛋白质含量则与GS、GOGAT和NR活性显著正相关，而且各个酶的活性均显著或极显著正相关。NR活性在各个时期均与叶片蛋白质含量呈显著正相关关系。

图6 不同氮素水平对各生长时期苎麻谷氨酸脱氢酶(GLDH)活性的影响Fig.6 Effects of different nitrogen levels on glutamic dehydrogenase (GLDH) activity of ramie at different growth periods

表2 不同氮素水平叶片蛋白质含量与氮代谢相关酶活性间的相关系数Table 2 The correlation coefficient of leaf protein content and enzyme activity related to nitrogen metabolism at different nitrogen levels

NR: 硝酸还原酶Nitrate reductase; GS: 谷氨酰胺合成酶Glutamine synthetase; GOGAT: 谷氨酸合成酶Glutamate synthase; GLDH：谷氨酸脱氢酶Glutamic dehydrogenase.*P<0.05. **P<0.01.

2.3不同氮素水平对苎麻抗性相关酶活性的影响

两个基因型苎麻CAT活性随氮素水平的提高均表现出明显的先升高后下降的趋势，并在N9处理下达到最大值(图7)。H2000-03在各生长时期均高于册亨家麻。N6、N9、N12下两者之间差异往往大于N0、N15，其中旺长期N6处理下两者存在显著差异(P<0.05)，N9、N12处理下H2000-03分别为册亨家麻的21.4%和23.2%，而N0、N15处理下差异均小于10%。

两个基因型苎麻的SOD活性随生长时间推进在低氮水平下整体表现增加，而在高氮水平下整体表现降低的趋势(图8)。在各生长阶段内，随着氮素水平的提高，H2000-03整体表现为升高趋势，而册亨家麻表现为先升高后降低的趋势。幼苗期和旺长期，H2000-03的SOD活性在低氮水平低于册亨家麻，而在高氮水平下相对较高；成熟期则均低于册亨家麻。

两个基因型苎麻POD活性在3个生长时期随着氮素水平的提高均呈现先升高后下降的现象，同一氮素水平下POD活性具有相同的变化特征(图9)。两个基因型在3个时期均表现为N9处理时呈现最大值，且显著高于其他处理(P<0.05)。两个基因型间的差异与SOD相似，表现为幼苗期和旺长期，H2000-03的在低氮水平低于册亨家麻，而在高氮水平下较高；成熟期则均低于册亨家麻。

图7 不同氮素水平对不同时期苎麻CAT活性的影响Fig.7 Effects of different nitrogen levels on catalase (CAT) activity of ramie at different growth periods

图8 不同氮素水平对不同时期苎麻SOD活性的影响Fig.8 Effects of different nitrogen levels on superoxide dismutase (SOD) activity of ramie at different growth periods

图9 不同氮素水平对不同时期苎麻POD活性的影响Fig.9 Effects of different nitrogen levels on peroxidase (POD) activity of ramie at different growth periods

2.4不同氮素水平下苎麻相关酶活性的综合评价

运用模糊隶属函数法，计算上述8个相关酶活性的隶属度函数值，进行排序后发现，两个基因型苎麻在不同氮素水平下的平均隶属度函数值排序均表现为N9>N12>N15>N6>N0(表3)。可见，苎麻对氮素的需求具有最适水平，较低或者较高均显著影响到苎麻氮代谢及抗性相关酶活性，进而会降低氮素利用效率。相对于低氮水平，苎麻更容易在高氮水平下表现出较强的氮代谢能力。结合苎麻株高和产量数据，进一步验证了这个结论。

表3 旺长期苎麻若干生理变化影响的综合评价Table 3 Comprehensive assessment on several physiological changes of ramie at rapid growth phase

3 讨论

3.1不同氮素水平对苎麻生长的影响

株高、鲜重和蛋白质含量是表征饲草生长速率、产量和品质的重要指标。研究得出，氮高效基因型苎麻在同一氮素水平下的生产力、氮素胁迫条件下的稳产性上均优于较氮低效基因型，具体表现在同一氮素水平下较高的株高、鲜重，适宜氮素水平下的叶片蛋白质含量及在持续提高氮素水平时稳产的特性上。研究还发现，苎麻对氮素的需要存在最适量，低于或高于最适水平将导致显著的产量降低或报酬递减现象，适宜氮素水平下不仅可获得氮肥投入与产量、品质的契合。这与文中对氮代谢及抗性相关酶的分析结果是一致的。

本研究采用的是盆栽试验，较严格地控制了温度、土壤水分和营养供给等条件，在对比不同氮素水平处理和苎麻基因型间的差异中可获得更客观的数据。但这与大田复杂的影响因素不同，因此进一步研究还须综合考虑多因素的互作。同时，盆栽试验针对单株苎麻，忽略了作物群体内的竞争关系及综合表现等因素，还需要进一步的研究来论证。

3.2不同氮素水平对苎麻氮代谢相关酶活性的影响

NR是硝酸氮同化的限速酶和调节酶，对植物吸收氮素至关重要，其活性的大小受植物体内氮素影响显著。胡润芳等[25]用不同形态氮素处理大豆(Glycinemax)，发现大豆花荚期高蛋白品种功能叶片中NR活性高于低蛋白大豆品种。张磊等[26]的研究得出了相似的结论。本研究中NR活性随着氮素水平增加而持续升高，而且两个基因型的差距越来越大，并在生长中后期的N15处理下差异显著(P<0.05)。表明氮高效基因型具有对氮素高吸收高转化能力，而且更高的施氮水平能够促进苎麻NR活性的提高。

GS/GOGAT是高等植物体内氨同化的主要途径[14,27]，可以把无机氮转化为有机氮，作为氨的贮存库，可以形成有机氮形式的有效转化，解除植物体内多余的氨态氮。GS是氮代谢中心的多功能酶，参与多种氮代谢的调节，GOGAT可以直接反映氨同化的强弱[28]。张国英[29]对水稻(Oryzasativa)碳氮代谢关键酶的研究表明，随着氮素的增加，GS活性不断升高，加速了无机氮的转化，在品种间和氮素水平处理间均表现为显著性差异；在高氮条件下，GOGAT活性升高增加了谷氨酸的合成，加强了体内氮素代谢，低氮条件下，侧重于增加氮素的吸收。本研究结果表明，苎麻在幼苗期和旺长期GS和GOGAT活性随着氮素水平提高而增加，说明此时对氨的同化较为活跃，氮高效基因型GS和GOGAT酶活性更强，主要表现为氮素的形式转化，成熟期后活性降低较为明显，说明随着植物叶片的衰老，其GS和GOGAT活性下降，氨同化合成受阻。H2000-03的GS和GOGAT活性高于册亨家麻，表明氮高效基因型具有更高的无机氮转化成有机氮的能力。

GLDH具有对GS/GOGAT循环的辅助作用。张国英[29]对水稻在低氮和高氮条件下对GLDH活性研究表明，由于GLDH对氨的亲和力较低，在氨同化作用中发挥的作用较小，GS/GOGAT循环在体内发挥主要作用，减少GLDH作用，可减少能量消耗。本研究发现苎麻H2000-03的GLDH活性较册亨家麻低，可见氮高效基因型更节约氮代谢的能量，而且氮低效基因型苎麻的GS/GOGAT循环能力较弱，需要通过GLDH增加对氨的吸收，来辅助苎麻对氮素的利用。GLDH活性也是随着氮素水平升高和生长时间推进均表现出增加的趋势，说明随着苎麻的生长，需要越来越强的GLDH活性来加强氮的吸收。

张智猛等[30]对花生(Arachishypogaea)叶片可溶性蛋白质含量与GS、GLDH和NR活性的关系研究表明，可溶性蛋白含量与GS和GLDH活性间的相互关系均不明显，但与NR活性达到显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)水平。李晶等[31]研究表明，小黑麦(Triticalerimpau)花后各时期，旗叶可溶性蛋白含量与NR和GS活性呈极显著(P<0.01)正相关，增施氮肥可以增强小黑麦花后叶片对氮素的同化能力，而GS活性与蛋白质合成关系密切，GS活性越高越有利于蛋白质合成[32]。也有研究表明NR活性的增加可以诱导GS和GLDH酶活性的提高[33]。本研究发现，苎麻生长较弱的幼苗期和成熟期，其叶片蛋白质含量与GLDH、NR活性显著相关，在旺长期则与GS、GOGAT和NR活性显著或极显著正相关，而且各个酶的活性均显著或极显著正相关。旺长期是决定苎麻产量的关键时期，将该时期的氮代谢相关酶作为高蛋白苎麻品种的选育指标之一，有利于提高苎麻的氮素利用效率和生产性能。

3.3不同氮素水平对苎麻抗性相关酶活性的影响

CAT、SOD和POD的高低可以衡量作物在逆境条件下的适应能力，间接通过改善植物的生理状况而增强作物氮代谢能力，提高产量和品质[34-35]。谢美玲[36]通过提高氮素水平增加了烤烟苗期叶片中CAT的活性，降低了MDA的含量，减轻了烟株膜脂氧化程度，并认为高氮水平处理可增加叶片SOD活性，延缓了叶片的衰老，利于烤烟苗期的生长。本研究结果表明，各时期苎麻CAT、SOD、POD随氮素水平的提高有先上升后下降的趋势，并在N9处理时达到最大值，这与王贺正等[37]的研究结果相似，说明合理施用氮肥可以提高抗氧化酶活性，增强苎麻对逆境的抵抗能力，延长叶片功能期，但施氮过量对抗氧化酶活性将起到抑制作用。刘连涛等[27]研究表明从盛铃末期开始，与中氮、高氮相比，低氮处理棉花(Gossypiumhirsutum)的SOD和POD活性降低，组织含水量和干物质积累量快速下降，而MDA含量快速升高，加速了棉株衰老的进程。增加氮素营养能够明显提高叶片的生理活性，延缓衰老。此研究结果与本研究中成熟期一致，氮素水平能提高抗氧化酶活性，有效清除体内活性氧，延缓成熟期苎麻叶片衰老速度。

3.4不同氮素水平下苎麻相关酶活性的综合评价

植物对氮素的生理生化反应受到许多因素的影响，不同的生理生化指标对氮素的影响也不尽相同，所以单个生理生化指标不能充分反映某一氮素浓度对其有害还是有利，因此需对多个生理生化指标进行综合分析。本研究对苎麻氮代谢关键酶(直接因素)和抗性关键酶(间接因素)进行了比较分析，并通过隶属函数法将影响苎麻氮代谢的两类因素，进行综合分析，有利于全面评价苎麻氮代谢能力。对旺长期苎麻的生理指标平均隶属函数值的比较，氮高效和氮低效基因型在不同氮素浓度的平均隶属函数值均表现为N9>N12>N15>N6>N0。可见苎麻在氮素代谢能力上存在较明显的最适水平，较高或较低均会降低苎麻氮素代谢能力。苎麻更偏向于高氮水平与苎麻品种选育中长期以耐重肥为主要选择性状之一有关。

另外，本研究的综合分析采用各项生理指标的平均隶属函数值为参考，由于本研究的各项指标随氮素水平的提高变化规律较明显，不会对结果产生影响，但尚没有考虑到各指标的权重，没有充分反映出不同氮素水平间的差距，这需要进一步的分析方法创新。

4 结论

氮高效基因型苎麻较氮低效基因型，在同一氮素水平下具有较高的生产力，在氮素胁迫条件下具有较高的稳产性。不同氮效率苎麻氮代谢关键酶和抗性相关关键酶随氮素水平的变化特征，及随生长时间的变化特征相似。氮高效基因型苎麻NR、GS、GOGAT、CAT活性及高氮水平下的SOD、POD活性均高于氮低效基因型，GLDH和低氮水平下的SOD和POD活性较低，整体表现出较高的生理响应和适应能力。苎麻各个生长时期NR活性随氮素浓度的提高逐渐升高，GS、GOGAT、GLDH、CAT、SOD、POD等酶活随氮素水平提高表现出较明显的先升高后下降的趋势，并可在适宜氮素水平下达到最大值。苎麻产量和株高可在该氮素水平下与氮代谢生理响应特征契合。苎麻更容易在高氮水平下表现出较强的氮代谢能力。旺长期氮代谢相关酶活性可作为品种选育的指标之一。

References：

[1] Kipriotis E, Heping X, Vafeiadakis T,etal. Ramie and kenaf as feed crops. Industrial Crops and Products, 2015, 68: 126-130.

[2] Xiong H P, Yu C M, Wang Y Z,etal. Study on selection and breeding of new feed ramie variety Zhongsizhu No.1. Plant Fibers and Products, 2005, 27(1): 2-5.

熊和平, 喻春明, 王延周, 等. 饲料用苎麻新品种中饲苎1号的选育研究. 中国麻业, 2005, 27(1): 2-5.

[3] Contò G, Carfì F, Pace V. Chemical composition and nutritive value of ramie plant [Boehmerianivea(L.) Gaud] and its by-products from the textile industry as feed for ruminants. Journal of Agricultural Science and Technology: A, 2011, 13(5): 641-646.

[4] Zhu T T, Yu C M, Wang Y Z,etal. Preliminary evaluation on nutritional value for ramie [Boehmerianivea(L.) Gaud.] Zhongzhu No.1 and Zhongzhu No.2. Plant Fiber Sciences in China, 2014, 36(3): 113-121.

朱涛涛, 喻春明, 王延周, 等. “中苎1号”和“中苎2号”苎麻营养价值的初步评价. 中国麻业科学, 2014, 36(3): 113-121.

[5] Van Tuyen D, Duy P B, Van Huy H. Evaluation of ramie (Boehmerianivea) foliage as a feed for the ruminant: MEKARN Regional Conference 2007: Matching Livestock Systems with Available Resources[Z]. Vietnam: 2007.

[6] Chen J K, Xiong H P, Yu C M,etal. Ramie fodder for grazing animals and preparation method thereof[P]. Chinese Patent: ZL201410144366. 6, 2014-07-02.

陈继康, 熊和平, 喻春明, 等. 一种草食动物用苎麻饲料及其制备方法[P]. 中国专利: ZL201410144366. 6, 2014-07-02.

[7] Chen J K, Xiong H P. Advances and suggestions of nitrogen fertilization in ramie production. Plant Fiber Sciences in China, 2016, 38(5): 229-236.

陈继康, 熊和平. 苎麻氮肥利用研究现状与建议. 中国麻业科学, 2016, 38(5): 229-236.

[8] Lominadze S, Nakashidze N. The influence of nitrogen fertilizers on nitrate accumulation in leaves of orange Washington Navel. Annals of Agrarian Science, 2016, 14(3): 233-236.

[9] Jiao J X, Yang W, Li Y Y,etal. Impact of combined manure and chemical fertilization on nitrogen leaching from paddy field in red earth hilly area of China. Journal of Agro-Environment Science, 2014, 33(6): 1159-1166.

焦军霞, 杨文, 李裕元, 等. 有机肥化肥配施对红壤丘陵区稻田土壤氮淋失特征的影响. 农业环境科学学报, 2014, 33(6): 1159-1166.

[10] Foley J A, Ramankutty N, Brauman K A,etal. Solutions for a cultivated planet. Nature, 2011, 478(7369): 337-342.

[11] Koutroubas S D, Ntanos D A. Genotypic differences for grain yield and nitrogen utilization in Indica and Japonica rice under Mediterranean conditions. Field Crops Research, 2003, 83(3): 251-260.

[12] Barraclough P B, Lopez-Bellido R, Hawkesford M J. Genotypic variation in the uptake, partitioning and remobilisation of nitrogen during grain-filling in wheat. Field Crops Research, 2014, 156(2): 242-248.

[13] Lam H M, Coschigano K T, Oliveira I C,etal. The molecular-genetics of nitrogen assimilation into amino acids in higher plants. Plant Biology, 1996, 47(47): 569-593.

[14] Lea P J, Miflin B J. Alternative route for nitrogen assimilation in higher plants. Nature, 1974, 251(5476): 614-616.

[15] Liu T M, Zhu S Y, Fu L L,etal. Morphological and physiological changes of ramie (BoehmerianiveaL. Gaud) in response to drought stress and GA3treatment. Russian Journal of Plant Physiology, 2013, 60(6): 749-755.

[16] Zheng J S, Yu C M, Chen P,etal. Characterization of a glutamine synthetase geneBnGS1-2 from ramie (BoehmerianiveaL. Gaud) and biochemical assays of BnGS1-2-over-expressing transgenic tobacco. Acta Physiologiae Plantarum, 2015, 37(1): 1-10.

[17] Liu L J, Chen H Q, Dai X B,etal. Effect of planting density and fertilizer application on fiber yield of ramie (Boehmerianivea). Journal of Integrative Agriculture, 2012, 11(7): 1199-1206.

[18] Bai Y C, Guo T, Yang R F,etal. Effect of nitrogen fertilization rate and cutting height on yields, nutritive values and root-rot incidence in forage ramie. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(12): 112-120.

白玉超, 郭婷, 杨瑞芳, 等. 氮肥用量、刈割高度对饲用苎麻产量、营养品质及败蔸的影响. 草业学报, 2015, 24(12): 112-120.

[19] Zhu C, Dai X B, Tang D L,etal. Effect of nitrogen and potassium fertilization on net photosynthetic rate and chlorophyll relative content of ramie. Plant Fiber Sciences in China, 2013, 35(5): 244-248.

朱聪, 代小兵, 汤涤洛, 等. 氮钾施肥对苎麻光合速率及叶绿素相对含量的影响. 中国麻业科学, 2013, 35(5): 244-248.

[20] Deng G, Liu L J, Zhong X Y,etal. Comparative proteome analysis of the response of ramie under N, P and K deficiency. Planta, 2014, 239(6): 1175-1186.

[21] Tang D L. Preliminary Study of Rooting Characteristics and Nitrogen Nutrition Based on Different Ramie Species[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2012.

汤涤洛. 苎麻不同品种生根特性及氮素营养初步研究[D]. 武汉: 华中农业大学, 2012.

[22] Zheng C F, Lin Z W. Rapid determination of glutamate synthase activity. Plant Physiology Communications, 1985, 21(4): 43-46.

郑朝峰, 林振武. 谷氨酸合酶活力的快速测定. 植物生理学通讯, 1985, 21(4): 43-46.

[23] Shanghai Institute of Plant Physiology CAS, Shanghai Society of Plant Physiology. Guide for Modern Plant Physiology Experiments[M]. Beijing: Science Press, 1999.

中国科学院上海植物生理研究所. 现代植物生理学实验指南[M]. 北京: 科技出版社, 1999.

[24] Zhang J, Kirkham M B. Antioxidant responses to drought in sunflower and sorghum seedlings. New Phytologist, 1996, 132(3): 361-373.

[25] Hu R F, Zhang G Q, Teng Z Y,etal. Effect of different nitrogens on activities of nitrate reductase, glutamine synthetase, and seed protein contents in soybean cultivars. Journal of Northeast Agricultural University, 2012, 43(1): 31-35.

胡润芳, 张广庆, 滕振勇, 等. 不同形态氮素对大豆硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性剂蛋白质含量的影响. 东北农业大学学报, 2012, 43(1): 31-35.

[26] Zhang L, Song Q L, Ma C M,etal. Study on dynamics of nitrate reductase activity in soybean leaves. Journal of Northeast Agricultural University, 2008, 39(6): 73-76.

张磊, 宋秋来, 马春梅, 等. 大豆叶片硝酸还原酶活性动态研究. 东北农业大学学报, 2008, 39(6): 73-76.

[27] Liu L T, Li C D, Sun H C,etal. Effects of nitrogen on cotton senescence and the corresponding physiological mechanisms. Scientia Agricultura Sinica, 2009, 42(5): 1575-1581.

刘连涛, 李存东, 孙红春, 等. 氮素营养水平对棉花衰老的影响及其生理机制. 中国农业科学, 2009, 42(5): 1575-1581.

[28] Mo L Y, Wu L H, Tao Q N. Research advances on GS/GOGAT cycle in higher plants. Plant Nutrition and Fertilizer Science, 2001, 7(2): 223-231.

莫良玉, 吴良欢, 陶勤南. 高等植物GS/GOGAT循环研究进展. 植物营养与肥料学报, 2001, 7(2): 223-231.

[29] Zhang G Y. Effects of Different Nitrogen Levels on GS and GLDH Activity and Expression of Key Enzymes of Carbon and Nitrogen Metabolism in Rice[D]. Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University, 2012.

张国英. 不同氮素水平处理对水稻碳氮代谢关键酶GS和GLDH活性及表达的影响[D]. 福州: 福建农林大学, 2012.

[30] Zhang Z M, Wan S B, Dai L X,etal. Effects of nitrogen application rates on nitrogen metabolism and related enzyme activities of two different peanut cultivars. Scientia Agricultura Sinica, 2011, 44(2): 280-290.

张智猛, 万书波, 戴良香, 等. 施氮水平对不同花生品种氮代谢及相关酶活性的影响. 中国农业科学, 2011, 44(2): 280-290.

[31] Li J, Ji B, Shang W N,etal. Effects of density and nitrogen on relevant enzyme activity of nitrogen metabolism and nutritional quality of grain in triticale. Plant Nutrition and Fertilizer Science, 2010, 16(5): 1063-1068.

李晶, 吉彪, 商文楠, 等. 密度和氮素水平对小黑麦氮代谢相关酶活性和子粒营养品质的影响. 植物营养与肥料学报, 2010, 16(5): 1063-1068.

[32] Wang X Y, Yu Z W. Differences in characteristics of quality and related enzymes activity of different wheat cultivars. Scientia Agricultura Sinica, 2005, 38(10): 1980-1988.

王小燕, 于振文. 不同小麦品种主要品质性状及相关酶活性研究. 中国农业科学, 2005, 38(10): 1980-1988.

[33] Wang Y F, Yu Z W, Li S X,etal. Effect of nitrogen nutrition on the change of key enzyme activity during the nitrogen metabolism and kernel protein content in winter wheat. Acta Agronomica Sinica, 2002, 28(6): 743-748.

王月福, 于振文, 李尚霞, 等. 氮素营养水平对冬小麦氮代谢关键酶活性变化和籽粒蛋白质含量的影响. 作物学报, 2002, 28(6): 743-748.

[34] Fernandez-Crespo E, Gomez-Pastor R, Scalschi L,etal. NH4+induces antioxidant cellular machinery and provides resistance to salt stress in citrus plants. Trees-Structure and Function, 2014, 28(6): 1693-1704.

[35] Almeselmani M, Deshmukh P S, Sairam R K,etal. Protective role of antioxidant enzymes under high temperature stress. Plant Science, 2006, 171(3): 382-388.

[36] Xie M L. Physiologicals and Differential Proteomic Analysis of Flue-cured Tobacco Seeding under Different Nitrogen Level[D]. Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University, 2011.

谢美玲. 不同氮素水平下烤烟苗期生理特性及差异蛋白组学研究[D]. 福州: 福建农林大学, 2011.

[37] Wang H Z, Zhang J, Wu J Z,etal. Effect of different levels of nitrogen on physiological characteristics of flag leaves and grain yield of wheat. Acta Prataculturae Sinica, 2013, 22(4): 69-75.

王贺正, 张均, 吴金芝, 等. 不同氮素水平对小麦旗叶生理特性和产量的影响. 草业学报, 2013, 22(4): 69-75.

Effectsofdifferentnitrogenlevelsonkeyenzymeactivitiesassociatedwithnitrogenmetabolismoffeedramie

CHEN Ji-Kang**, TAN Long-Tao**, YU Chun-Ming, ZHU Ai-Guo, CHEN Ping, WANG Yan-Zhou, ZHU Tao-Tao, XIONG He-Ping*

InstituteofBastFiberCrops,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Changsha410205,China

Ramie (Boehmerianivea) is an important source of plant protein in South China. Few studies investigating the physiological mechanisms of nitrogen utilization in feed ramie have been reported. To evaluate the activities of key enzymes associated with nitrogen metabolism in ramie, a potted experiment was conducted under different nitrogen levels. Two ramie varieties, H2000-03 which has high nitrogen utilization efficiency (NUE, 46.01%) and Ceheng Jiama with low NUE (15.81%) were treated with 0, 6, 9, 12 and 15 mmol/L nitrogen, and enzyme activity tested at the seedling stage (15 days), maximum growth (40 days) and at maturity (54 days). The results showed that as nitrogen concentration increased plant height, fresh yield and leaf protein content of both varieties increased and subsequently decreased or plateaued, indicating that the range of treatments imposed was able to meet the nitrogen requirement of the ramie plants. Plant height and fresh yield of H2000-03 were significantly higher than that of Ceheng Jiama under all treatments. The leaf protein content of H2000-03 was distinctly higher than that of Ceheng Jiama under a range of nitrogen levels (9-12 mmol/L). These results suggest that H2000-03 has better productivity under a range of nitrogen availabilities and more stable production under nitrogen deficient conditions. At different growth periods, the activity of NR (nitrate reductase) in H2000-03 and Ceheng Jiama gradually increased with increased nitrogen supply, while the activities of glutamine synthetase (GS), glutamate synthase (GOGAT), glutamic dehydrogenase (GLDH), catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and peroxidase (POD) first increased and then decreased. The activities of POD, GS, GOGAT, CAT in H2000-03 under all nitrogen levels and the activities of SOD and POD under high nitrogen levels were higher than in Ceheng Jiama, while lower GLDH at all nitrogen levels and lower SOD and POD at low nitrogen levels were detected in H2000-03 compared to Ceheng Jiama. These results indicate that H2000-03 had a better physiological response and adaptability to different nitrogen fertility levels. The dynamic characteristics of ramie yield and quality were consistent with enzyme activity related to nitrogen metabolism and resistance which could be used to monitor and characterize nitrogen utilization differences among genotypes. Our research suggests that an appropriate nitrogen fertility range, rather than continuously increasing nitrogen should be ascertained to coordinate productivity with physiological characteristics. The activity of key enzymes during the rapid growth phase is suggested as an important trait for feed ramie breeding.

feed ramie; nitrogen use efficiency; nitrogen metabolism; plant resistance; enzyme activity

10.11686/cyxb2016501http//cyxb.lzu.edu.cn

陈继康, 谭龙涛, 喻春明, 朱爱国, 陈平, 王延周, 朱涛涛, 熊和平. 不同氮素水平对饲用苎麻氮代谢关键酶的影响. 草业学报, 2017, 26(10): 207-218.

CHEN Ji-Kang, TAN Long-Tao, YU Chun-Ming, ZHU Ai-Guo, CHEN Ping, WANG Yan-Zhou, ZHU Tao-Tao, XIONG He-Ping. Effects of different nitrogen levels on key enzyme activities associated with nitrogen metabolism of feed ramie. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(10): 207-218.

2016-12-28；改回日期：2017-03-14

湖南省科技计划重点研发计划项目(2016NK2205)，国家麻类产业技术体系建设专项(CARS-19)和中国农业科学院科技创新工程多年生麻类作物遗传改良团队资金(ASTIP-IBFC04)资助。

陈继康(1985-)，男，宁夏海原人，助理研究员。E-mail: chenjikang@caas.cn。谭龙涛(1984-)，男，黑龙江佳木斯人，在读博士。E-mail: 3828134@163.com。**共同第一作者These authors contributed equally to this work.

*通信作者Corresponding author. E-mail: ramiexhp@vip.163.com